וגם בידוד Immunostaining ימפוציטים ותאי דנדריטים מהתיקונים של Peyer Murine

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד ולאימונסטית לימפוציטים ותאים דנדריטיים ממדבקות משלמי נוירונים, תוך שימוש בשתי גישות ניסיוניות מקבילות. ראשית, הסר טלאים טריים מהעכבר, המעי הדק. לאחר מכן נתק פיזית את המדבקות של המשלם, קצור את הרקמה והעביר אותה דרך מסנן רשת כדי ליצור תרחיף תא בודד לניתוח ציטומטריית זרימה.

קצרו את התאים על ידי צנטריפוגה והפיצו אליקוטים בצלחת תחתונה עגולה של 96 באר. לאחר מכן, סמנו את התאים בנוגדנים כנגד סמני משטח ספציפיים לסוג התא. המשך מיד לניתוח ציטומטרי זרימה כדי לספור את סוגי התאים הספציפיים במקביל לבודד את מדבקות המשלם ולהצמיד דגימות רקמה להקפיא.

בבלוקים של OCT, חתך קריו, הדגימות מסומנות בנוגדנים כנגד סמני משטח ספציפיים לסוג התא ולאחר מכן מדומות על ידי מיקרוסקופ לייזר סריקה קונפוקלית שנלקח יחד. שיטות אלו יכמתו תאי B, תאי T ותאים דנדריטיים בתאים ספציפיים בתוך רקמות התיקון של המשלם. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שרקמות המדבקה של PI הן שבריריות ביותר ועלולות להינזק בקלות.

במהלך הטיפול. הניחו את המעי הדק המבודד הטרי על מצע של מגבות נייר לחות או מגבוני קים. לאחר מכן הרטיבו את המעי הדק בעדינות במי מלח כדי למנוע התייבשות רקמות.

כעת, זהה חזותית טלאים משלמים בודדים הממוקמים בצד האנטי מזנטרי של המעי. בדרך כלל, לעכבר בודד יש חמישה עד 10 טלאים משלמים גלויים המופצים באופן שווה מהתריסריון לאילאום. שימוש במספריים כירורגיים מעוקלים בדרך כלל מסיר את התיקונים של המשלם הבודד.

הנח אותם בתמיסת מיון איזון קרה, תוך שמירה על הרקמה בארבע מעלות צלזיוס כדי לשמור על כדאיות התאים. לאחר מכן, העבירו את מדבקות המשלם לחמישה מיליליטר של מדיום דיסוציאציה של טחול ונערו ב-250 סל"ד למשך 15 עד 20 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן כדי ליצור תרחיף תא בודד, הנח את הדגימה על מסננת תאי רשת ניילון סטרילית של 70 מיקרון וטחן בכוח את הרקמה לתוך הרשת באמצעות בסיס בוכנה ממזרק סמ"ק אחד כדי להסיר אגרגטים תאיים שנותרו.

שפכו את תרחיף התא דרך תא שני של 70 מיקרון, מסננים ואוספים את התאים בצינור חרוטי של 15 או 50 מיליליטר. הוצא 10 עד חמשת התאים לבאר לתאי גלולה עגולים של 96 באר על ידי צנטריפוגה למשך חמש דקות ב-1000 פעמים. ז. לאחר מכן שפכו את הסופרנטנט על ידי היפוך עדין של הצלחת.

כעת השעו מחדש את התאים במאגר בלוק FC ודגרו על קרח למשך 15 דקות. לאחר מכן, הוסף נוגדנים מצומדים פלואור ישירות לתרחיף התאים בדילול הרצוי ודגירה על תאי שטיפת קרח עם 100 מיקרוליטר של מאגר זרימה. לאחר מכן השעו מחדש את התאים ב-400 מיקרוליטר של מאגר קיבוע כדי לנתח את התאים על ידי זרימה ציטומטרית כדי לבודד טלאים משלמים להקפאה.

חותכים מקטעים רוחביים של 0.5 סנטימטר של המעי הדק המכילים מדבקת משלם יחידה. מעבירים את הטישו לצלחת פטרי המכילה PBS. לאחר מכן הנח את מקטעי רקמת המעי אנכית בתוך תבניות בסיס המכילות OCT.

טבלו את התבניות בחנקן נוזלי ואפשרו לרקמות לקפוא לחלוטין. הסר את תבניות הבסיס הקפואות מהחנקן הנוזלי בעזרת מלקחיים. הניחו לתבנית להתחמם בטמפרטורת החדר מספיק זמן כדי שהקצוות של בלוק ה-OCT יתרככו.

לאחר מכן הסר את גוש ה-OCT הקפוא מהתבנית. הפוך את התבנית ולחץ בעדינות על הגב כדי להוציא את הבלוק על פיסת נייר אלומיניום נקייה של ארבעה על ארבעה סנטימטרים. עטפו מיד את הרקמה בנייר כסף והניחו בשקית דגימה מסומנת המאוחסנת בחנקן נוזלי או על קרח יבש חתך את הרקמה באמצעות LI a CM 3 0 5 0 s cryo microtome או שווה ערך.

הגדר את טמפרטורת החדר על הקריוסטט למינוס 21 מעלות צלזיוס. חותכים באופן אידיאלי קטעים בעובי של 12 עד 14 מיקרון. אסוף את החלקים על שקופיות מיקרוסקופ Supercross בתוספת זכוכית.

בדוק את הדגימות באופן ויזואלי באמצעות מיקרוסקופ אור רגיל בעל הספק נמוך. טבלו את השקופיות באצטון למשך שתי דקות. שימו לב שדגירה ממושכת עלולה לגרום לרקמות להתנתק מהמגלשה.

שוטפים את הדגימות שלוש פעמים עם PBST. לאחר מכן הקיפו את החלקים בעט הידרופובי תמונה. כעת דגרו את הדגימות במאגר בלוק, כסו את חלקי הרקמה בתמיסת נוגדנים ראשונית.

יבש את האזור סביב החלקים באמצעות מגבוני קים או רקמה סופגת אחרת מבלי לגעת בקטעי הרקמה עצמם. בעזרת פיפטה או טפטפת, הנח בעדינות טיפה של אמצעי הרכבה זהב ממושך ישירות על הקטע. מרחו החלקה על כיסוי זכוכית, הימנעו מבועות אוויר ומחקו כל הרכבה עודפת.

ניתוח פקס בינוני של תרחיפים מפוזרים מונו של סך תאי התיקון של המשלמים חושף הבחנה ברורה בין תכשירי תאים טובים וגרועים בתכשירים תאיים טובים. עם למעלה מ-80% כדאיות, הרוב המכריע של התאים מפגינים פיזור גבוה קדימה המעיד על נפח תאים גבוה ופיזור צד נמוך התואם לגרעיניות תאים נמוכה. בניסוי זה, הכנת תאים לקויה הוכנה בכוונה כדי להוכיח שבאוכלוסייה גרועה, רוב התאים מציגים FSC נמוך, SSC גבוה, ונמצאים מחוץ להליכה R המצוינת.

תאים אלה ככל הנראה עוברים אפופטוזיס ו/או נמק. הנה קוקטייל של עד ארבעה פלואור שונים. ארבעה נוגדנים חד-שבטיים מצומדים להבחנה בין מגוון סוגי תאים.

בתיקון משלמים נעשה שימוש בתרחיפי תא בודד עם מקבץ של סמני התמיינות. CD 19 ו-B 2 20 מגלים שתאי B מהווים כ-60% מהמשלמים המגודרים. ניתן לספור בקלות תת-קבוצות ספציפיות של תאי T לאוכלוסיית תאי טלאי על ידי תיוג כפול עם נוגדנים כנגד CD 3 ו-CD 4, או CD 3 ו-CD 8, CD 4 חיובי ו-CD 8 חיובי תאי T מהווים כ-23% ו-9% בהתאמה מכלל תאי התיקון המשלמים.

ניתן למנות גם את תת-הקבוצות של DC, הן יהיו CD 11 C חיובי ו-CD 1 0 3 חיובי בשיטה זו. CD 11 C חיובי dcs תורם לכ-8% מכלל האוכלוסייה המגודרת, שזה בערך שווה ערך ל-10,000 dcs לכל תיקון משלם. בקרב אוכלוסיית התאים החיוביים ל-CD 11 C, כ-4.7% היו חיוביים כפולים ל-B 20 חיוביים.

תוצאות דומות מתקבלות כאשר תאים טלאים משלמים נאספים משישה עכברים שחורים C 57. הכנת תאים גרועה עלולה להוביל לתוצאות מטעות ביותר, בעיקר מכיוון שתאים מתים או גוססים נוטים לקשור נוגדנים באופן לא ספציפי. בדרך כלל, אלה מובילים לייצוג יתר של B 2 2 0 חיובי ו-CD שלושה תאים חיוביים כפולים, כמו גם B שני 20 תאי B חיוביים ו-CD ארבעה תאי T חיוביים כפולים.

קטעי הקריו של משלמי העכבר ניתנים לניתוח היסטופתולוגי כמו גם לתיוג חיסוני. בעוד שהעוצמה של החלקים מספקת רזולוציה רבה יותר ברמה התאית כאשר הם מוכתמים על ידי h ו-e, האזורים הבהירים והכהים של מרכזי הנבט של תיקון המשלמים מסומנים ביתר קלות בקטעי חתך קריו. בקטע טיפוסי זה של תיקון קריו, נוגדנים נגד CD שלושה, מסמנים את תאי ה-T נוגדנים נגד CD 11 C.

הדגש תאים דנדריטיים ואנטי B שני 20 נוגדנים. הדגש את תאי B לאחר התפתחותו. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום להבין כיצד סוגי תאים ספציפיים כמו תאים דנדריטיים בתוך רקמות לימפה הקשורות למעי מגיבים לאנטיגנים במעי ופתוגנים מיקרוביאליים.

מידע זה השפיע על תכנון ופיתוח חיסון רירי