ניתוח של דגימות כירורגית transcriptomic רשתית אדם שימוש Journal
14 באוגוסט 2013
אנחנו השתמשנו בדגימות מרשתית retinectomy לניתוח transcriptomic של היפרדות רשתית. אנחנו פיתחה הליך המאפשר שימור RNA בין גושי הניתוח והמעבדה. אנחנו טופל בפרוטוקול כדי לטהר הרנ"א על ידי ultracentrifugation צזיום כלוריד כדי להבטיח שRNAs המטוהר מתאים לניתוח microarray.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לטהר RNA מדגימות כירורגיות רשתית אנושיות לניתוח טרנסקריפטום בניתוק רשתית. באמצעות יומן לשם כך, הריאגנטים והחומרים הדרושים לאיסוף הדגימה הכירורגית מוכנים במעבדה ונשלחים לבית החולים. במהלך ההליך הכירורגי נאספת הדגימה ומוחזרת למעבדה.
לאחר מכן מטוהר ה-RNA באמצעות הליך שיפוע צזיום כלוריד סטנדרטי ומוערכת איכות ה-RNA המטוהר. בסוף. ניתוח ביטוי mRNA מראה כי גם דלקת וגם ניוון קולטני אור מעורבים בניתוק רשתית המסומן על ידי שינויים בביטוי של גנים מרכזיים. בתהליכים אלה שזוהו על ידי ניתוח טרנסקריפטומי, היתרון העיקרי של כתב העת על פני טיהור אורנה קיים כגון GTIN כלור ממיצוי, הידוע גם בשם ole, הוא התוצאה של האורנה אינה מזוהמת ב-DNA.
היישום של טכניקה זו משתרע לקראת טיפולים בהיפרדות רשתית מכיוון שהיא מספקת אמצעים טכניים לפיתוח טיפולים משלימים חדשים. עבור כל דגימה שיש לאסוף, השתמש בפיפטה נטולת RNA כדי למלא צינור תחתון עגול מפוליאתילן סטרילי של חמישה מיליליטר ב-2.4 מיליליטר של תמיסת גינא כלוריד נטולת RNA מולארית. השתמש בגז ארגון כדי למלא את החלק העליון של הצינורות.
לאחר מכן הנח במהירות את הכובע ולחץ בחוזקה כדי להבטיח שהוא אטום. זה ימנע חמצון של גינאה כלוריד במשך מספר שנים של אחסון בארון הניתוחים. לאחר מכן, הניחו כל אחד מחמשת צינורות המיליליטר בצינור תחתון חרוטי מפוליפרופילן סטרילי בנפח 50 מיליליטר.
לאחר הוספת רקמה והברגה של המכסה, הניחו את צינורות 50 מיליליטר במתלה פוליסטירן. לאחר מכן הניחו את המתלה והמעטפות המוכנות יחד עם טפסי משלוח מוכנים בקופסת קרטון בבית החולים. הביאו את קופסת הקרטון מארון הניתוחים לחדר הניתוח.
במהלך הניתוח יש להכניס את דגימת הרשתית לתוך צינור מלא בתמיסת כמות וכלוריד. סגור את הצינור בחוזקה. מערבבים את הצינור בקצרה.
לאחר מכן הנח את הצינור על נדנדת צינור הדם למשך 10 דקות. מלא את טופס המדגם הנלווה עם זיהוי המטופל, תאריך הניתוח וכל הערה נוספת. לאחר מכן כתוב את מספר הזיהוי על השפופרת הממוספרת המתאימה של 50 מיליליטר.
לאחר מכן הנח את הצינור של חמישה מיליליטר עם הדגימה הכירורגית לתוך הצינור של 50 מיליליטר. החלף את טישו הנייר ומכסה את הצינור. לאחר מכן הנח את צינור ה-50 מיליליטר וצורת צריכת הדגימה לתוך המעטפה המרופדת המתאימה ואטום אותה.
לאחר קבלת הדגימה במעבדה, הומוגניזציה של הדגימה בצינור של חמישה מיליליטר עם הומוגנייזר פוליטרון TM בהגדרה המקסימלית למשך דקה אחת תוך הזזת הצינור למעלה ולמטה. לאחר שהדגימה הומוגנית, כדי לחלץ את הפוליסכרידים, הוסף 270 מיקרוליטר של שני אשלגן אצטט מולארי והנח את הצינור על שייקר במצב אופקי. מנערים במרץ במשך 10 דקות, ואז צנטריפוגה למשך 10 דקות בחום של 6, 500 גרם ב -20 מעלות צלזיוס.
לאחר הסיבוב, השתמש בפיפטה כדי לשאוב בזהירות את החלק המסיס מבלי להפריע לגלולה. העבירו את הסופרנטנט לצינור נטול RNA סטרילי של 14 מיליליטר. ליד הסופרנטנט, הוסיפו 5.3 מיליליטר של 1% ולורל סרקוזין ב-100, טרי מילי-מולארי ו-3.2 גרם צזיום כלוריד.
הסרקוזין ימס את הממברנה והצזיום כלוריד משמש ליצירת שיפוע. מערבבים את הצינור על ידי מערבולת למשך דקה אחת. הוסף 1.8 מיליליטר של צזיום כלוריד EDTA לצינור צנטריפוגה פולימרי סטרילי של 11 מיליליטר.
לאחר מכן, בעזרת פיפטה סטרילית של 10 מיליליטר, שכבו את תמיסת ה-RNA על תמיסת EDTA של צזיום כלוריד על ידי כך שתאפשרו לה לזרום לאורך המשטח הפנימי של הצינור. מניחים את הצינורות בצנטריפוגה. השתמש בצינור שני המכיל את המאגרים ללא רשתית כאיזון במידת הצורך, וסובב במשך 24 שעות ב-225,000 גרם ב-20 מעלות צלזיוס.
למחרת. לאחר הסיבוב תיווצר שכבת שומנים בחלק העליון של הצינור. הדנ"א יהיה באמצע והרנ"א יופעל בתחתית הצינור.
השתמש בפיפטה סטרילית כדי להסיר בזהירות ולהשליך את שכבת השומנים העליונה בעזרת פיפטה סטרילית שנייה. הסר את התמיסה בהדרגה עד לשאיבת ה- DNA הצמיג. השלך את התמיסה וה- DNA.
לאחר מכן בעזרת פיפטה סטרילית שלישית, הסר והשליך את התמיסה שנותרה. הקפד לא להפריע לכדור ה-RNA. כעת בעזרת אזמל מעוקר להבה, חותכים את הצינור כפי שמוצג כאן וזורקים את החלק העליון.
הניחו את החלק הנותר הפוך על גזה סטרילית. הפוך את הצינור והשתמש בפיפטה כדי לשטוף אותו בעדינות עם 160 מיקרוליטר גינאה כלוריד. תן לגלולה להתייבש במשך 10 דקות.
לאחר שהגלולה יבשה, מושעה מחדש ב-150 מיקרוליטר טריס, E-D-T-A-S-D-S. לאחר מכן, הוסיפו 150 מיקרוליטר של טריס, EDTA ו-30 מיקרוליטר של שלושה נתרן אצטט מולארי, ואז מערבולת כדי לזרז את ה-RNA. הוסף 900 מיקרוליטר קר כקרח, 100% אתנול.
מערבל את הצינור ומניח אותו על קרח נמס למשך 30 דקות. לאחר מכן צנטריפוגה את הצינור 30 דקות ב -18, 000 גרם בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הסיבוב, כדור לבן זעיר עשוי להיות גלוי או לא.
בין אם ניתן לראות את הכדור ובין אם לאו, שאפו בעדינות את הסופרנטנט והשליכו אותו. לאחר מכן כדי להסיר עודפי מלח, הוסיפו 500 מיקרוליטר טמפרטורת החדר, 70% אתנול ומערבולת, צנטריפוגת הצינור, הצינור למשך 20 דקות ב -18, 000 גרם בארבע מעלות צלזיוס. לאחר חזרה על השטיפה והסיבוב של 70% אתנול, השתמש בפיפטה P 200 כדי להסיר את כל האתנול שנותר.
תן לגלולה להתייבש באוויר במשך 10 דקות. השעו מחדש את הגלולה ב-50 מיקרוליטר של תערובת מים מטופלים במרץ על ידי מערבולת למשך שתי דקות. לאחר מכן הניחו את הדגימה באמבט מים של 45 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
להשעות לחלוטין את ה-RNA. לבסוף, קבע את ריכוז ה- RNA על ידי ספיגה ב -260 ננומטר ונתח את ה- RNA על ידי אלקטרופורזה של ג'ל על פי הפרוטוקול. במסמך הנלווה, כדי לבחון את הטרנסקריפטום של היפרדות רשתית, נעשה שימוש בהליך היומן לשחזור וניתוח RNA רשתית מ-18 חולים עם היפרדות רשתית ו-18 בקרות תואמות גיל שהוכנו באמצעות רשתית לאחר המוות.
RNA טוהר ונותח לאחר מכן באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל ובסיס רטינו כמתואר בדוח זה, המוצגים כאן הם גרפים מכ"מיים המייצגים את הביטוי של הכימו-טקטי המונוציטי M CP גן אחד CCL שניים. החלק הימני של האיור המסומן RD מתאים ל-RNA מחולי היפרדות הרשתית, בעוד שהחלק השמאלי המסומן N הם RNA מבקרות כפי שניתן לראות כאן. היפרדות רשתית גורמת לוויסות מוגבר של CCL 2 כפי שמצוין על ידי ערכי C הגבוהים ברוב דגימות ה-RD מימין בהשוואה לאלו של הבקרות משמאל.
עלייה זו מצביעה על דלקת בחולים עם היפרדות רשתית כפי שניתן לראות כאן. הביטוי של קולטן האור המוט המתמר את הגן GNAT 1 ירד בניגוד ל-CCL 2, הערכים נמוכים עבור דגימות ה-RD מימין, ירידה בביטוי של חרוט הגל הקצר Opsin O PN אחד SW, והגן ההומאו CRX נצפה גם הוא מה שמרמז על ניוון קולטני אור של מוטות וחרוטים בחולים עם ניתוק רשתית באמצעות שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי שינויים בביטוי גנים בעקבות היפרדות רשתית. ניתן ליישם אותו גם על פתולוגיה אחרת של הרשתית במודלים של בעלי חיים כגון ניוון רשתית תורשתי.
אנשים חדשים בשיטה זו עשויים להיאבק מכיוון שהיא דורשת ידע בחומצת גרעין. Cy.הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית כעבודה, אשר RNA לאחר ההסמכה הוא מסובך.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מתמקד בטיהור RNA מדגימות כירורגיות של רשתית אנושית על מנת לנתח את התעתק השליח (transcriptome) במקרים של היפרדות רשתית. נעשה שימוש בפרוצדורת מדרג צסיום כלוריד סטנדרטית כדי להבטיח את איכות ה-RNA לצורך ניתוחים נוספים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של הרשתית
- טרנסקריפטומיקה
רקע
- היפרדות רשתית עלולה להוביל לאובדן ראייה משמעותי.
- הבנת השינויים בביטוי גנים היא חיונית לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות.
- איכות ה-RNA חיונית לביצוע ניתוח טרנסקריפטומי מדויק.
- שיטות קיימות לטיהור RNA עלולות להוביל לזיהום.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה מהימנה לטיהור RNA מדגימות רשתית.
- ניתוח ביטוי mRNA הקשור להיפרדות רשתית.
- הערכת המעורבות של דלקת וניוון פוטורצפטורים.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- איסוף דגימות רשתית במהלך כריתת רשתית (retinectomy).
- הכנת ריאגנטים וחומרים להפקת RNA.
- פרוצדורת מדרג צסיום כלוריד סטנדרטית לטיהור RNA.
- הערכת איכות ה-RNA לצורך אנליזת מיקרומערך (microarray).
תוצאים עיקריים
- זיהוי שינויים מרכזיים בביטוי גנים הקשורים להיפרדות רשתית.
- ראיות לדלקת ולניוון של פוטורצפטורים בניתוח הטרנסקריפטומי.
- הדגמה כי השיטה החדשה מונעת זיהום ב-DNA.
- שיפור באיכות ה-RNA באופן המתאים לניתוח microarray.
מסקנות
- שיטת טיהור ה-RNA שפותחה יעילה עבור דגימות רשתית.
- ניתוח טרנסקריפטומי מספק תובנות לגבי המנגנונים של היפרדות רשתית.
- מחקרים עתידיים יכולים להשתמש בשיטה זו למחקר נוסף במחלות רשתית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
היפרדות רשתית מעוררת דלקת וניוון של הפוטורצפטורים בו-זמנית, ובכך יוצרת סביבה פתופיזיולוגית מורכבת המקשה על פיתוח טיפולים. שיטת jouRNAl מאפשרת פרופיל טרנסקריפטומי ברמת דיוק גבוהה של דגימות רשתית אנושיות שהוצאו בניתוח, ובכך מספקת מקור בר-הרחבה של רקמה רלוונטית למחלה לצורך תיקוף של מטרות טיפוליות. גישה זו תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי קישור חתימות מולקולריות לפנוטיפים קליניים, ובכך מספקת בסיס לקבלת החלטות לגבי המשך או הפסקת פיתוח בקווי ייצור בתחום האופתלמולוגיה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות זיהוי סימולטני של מסלולים דלקתיים וניווניים ברקמת רשתית אנושית.
- ערך תפעולי: הופך דגימות כירורגיות שנזרקו למערכות ביולוגיות מתוקפות, ובכך מפחית את ההסתמכות על מודלים של בעלי חיים להערכה מוקדמת של מטרות טיפוליות.
- ערך חיזוי: תומך במיון תיקי פיתוח על ידי אספקת נתוני ביטוי ממקור אנושי של CCL2, GNAT1, OPN1SW, ו-CRX כסמנים ביולוגיים להתקדמות של RD.
סקר ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מספק RNA נקי מ-DNA המתאים ל-microarray ול-RT-PCR, ובכך מבטיח את ספציפיות הבדיקה עבור קריאות של ביטוי גנים.
- ערך תפעולי: פרוטוקול סטנדרטי של מדרג צסיום כלוריד מבטיח הדירות בין סדרות ואתרים שונים, מה שמאפשר קמפיינים של סריקה בקנה מידה רחב.
- מוכנות לבדיקה: איכות ה-RNA המבודד תוקפה באמצעות אלקטרופורזה בג'ל ובבדיקת בליעה, מה שתומך בהערכה אמינה של תרכובות בסריקות פנוטיפיות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מגשרת בין השלב הגילוי לעבודה הפרה-קלינית באמצעות שימוש בדגימות רשתית אנושיות כדי לתקף ממצאים במודלים של בעלי חיים לניוון רשתית תורשתי.
- הלימה של סמנים ביולוגיים: מזהה את העלייה בביטוי של CCL2 ואת הירידה בביטוי של גנים של פוטורספטורים כחתימות ניתנות לתרגום לניטור טיפולי.
- קידום מותאם סיכונים: מספקת תובנה מכניסטית לגבי התקדמות RD, ובכך מסייעת לתכנון ניסויים קליניים המבוססים על סטרטיפיקציה של סמנים ביולוגיים.
שילוב בקו תהליך ובזרימת עבודה
שיטת jouRNAl משתלבת ברצף הגילוי, החל מזיהוי מטרות מוקדם ועד לתיקוף פרה-קליני, ובכך מאפשרת הפחתת סיכונים מבוססת רקמות אנושיות לפני אופטימיזציית המולקולה המובילה.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות לגבי מסלולי דלקת וניוון באמצעות ניתוח טרנסקריפטומי של דגימות רשתית אנושיות.
- סריקה: מספקת תוצרי RNA כמותיים וסטנדרטיים המתאימים לפרופיל ביטוי גנים בייצור המוני (high-throughput).
- אנליטיקה: מייצרת מדדים מדידים (למשל, upregulation של CCL2, downregulation של GNAT1) המאפשרים השוואה בין תנאים ותעדוף מטרות.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין נתוני דגימות אנושיות לרצף פרה-קליני על ידי אפשור ניתוח השוואתי במערכות רלוונטיות למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה לשימוש חוזר להפקת RNA מרקמות כירורגיות, הישימה על פני פתולוגיות של הרשתית ותחומי טיפול שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי על ידי הפחתת העמימות המכניסטית באמצעות טרנסקריפטומיקה ישירה של רקמה אנושית.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה ושחזור באמצעות טיהור בקיסר חלוריד (cesium chloride), תוך מזעור השונות בין סדרות במחקרים רב-מרכזיים.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות ה-go/no-go באמצעות אספקת ראיות מולקולריות ממקור אנושי, ובכך מפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים בתוכניות בתחום האופתלמולוגיה.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של מטרות מותאם לסיכון, בהתבסס על חתימות מקבילות של דלקת וניוון בדגימות שהופקו מחולים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול בחומצות גרעיניות ובטכניקות של אולטרה-צנטריפוגציה במדרג (gradient ultracentrifugation).
- תלוי בגישה לקיסריום כלוריד, לאולטרה-צנטריפוגות ולתשתית מעבדתית נקייה מ-RNase.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית בין היחידות הכירורגיות, הפתולוגיות והביולוגיה המולקולרית לצורך מעקב אחר הדגימות.
- התאמה לסוגי רקמות אחרים עשויה לדרוש אופטימיזציה של שלבי ההומוגניזציה והליזיס.
- מגבלה מעשית: תנובת ה-RNA תלויה בהעברה מהירה של הדגימות ובמניעת חשיפה ל-RNase במהלך האיסוף הכירורגי.
