טריפסין תקציר פרוטוקול לניתוח בכלי הדם של רשתית מודל עכבר
13 ביוני 2013
טריפסין עיכול הוא אחת מהשיטות הנפוצות ביותר לניתוח כלי הדם ברשתית. כתב יד זה מתאר את השיטה בפירוט, כולל שינויים מרכזיים כדי לייעל את הטכניקה ולהסיר את הרקמה ללא כלי הדם תוך השמירה על הארכיטקטורה הכוללת של כלי הדם.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד את רשת כלי הדם ברשתית. זה מושג על ידי ביצוע תחילה סדרה של שטיפות מים על הרשתית המבודדת. בשלב השני, הרשתית מתעכלת בטריפסין בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך כשעה עד שעה וחצי, תלוי בגודל הרשתית.
לאחר מכן, כלי הדם מבודדים באמצעות שטיפות מים נוספות ודיסקציה תחת מיקרוסקופ. בסופו של דבר, ניתן לדמיין שינויים פתולוגיים בכלי הדם כגון מיקרו מפרצת, ניוון נימי ויחס לא תקין של תאי אנדותל לטפילים. אז היתרון העיקרי של ניסיון ועיכול על פני שיטות קיימות כמו הכנת תושבות שטוחות ברשתית הוא שניתן להדגיש את כל רשת כלי הדם בבהירות רבה.
בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שהיא מאתגרת מבחינה טכנית וקשה לביצוע עקבי. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד את שלבי בידוד כלי הדם במילים בלבד. זהו כלי בעל ערך רב בכל מעבדה שמבצעת מחקרים על ביולוגיה של כלי הדם ברשתית כמו מחלות מסוימות כמו רטינופתיה סוכרתית, מה שמדגים את הטכניקה הזו יהיה ג'ונתן צ'או, סטודנט מוכשר לרפואה מהמעבדה שלי.
לאחר קיבוע עין העכבר הגרעינית ופורמין ניטרלי של 10% למשך 24 שעות, הניחו את העין בצלחת פטרי וכסו אותה בכמות קטנה של מים. התחל את הדיסקציה באמצעות מספריים לדיסקציה כדי לבצע בזהירות חתך ראשוני בקרנית. לאחר מכן, תוך כדי החזקת אזור החיתוך עם מלקחיים ישרים, השתמש במספריים כדי לחתוך לאורך גבול הקרנית והסקלרה מסירה את הקרנית.
לאחר מכן, השתמש במלקחיים עדינים, מעוקלים וישרים. לקלף לאט ובזהירות את הסקלרה והכורואיד הרחק מהרשתית לכיוון עצב הראייה. לאחר מכן הסר את העדשה וכל עודפי הקשתית והפסולת מהרשתית כדי לסייע בהפרדת שכבות הרשתית העצבית מכלי הדם.
בכ-500 מיקרוליטר של 45 מיקרומטר מסוננים מים לצלחת של 24 בארות ומניחים את הרשתית בבאר ואז מנערים בעדינות במשך ארבע עד חמש שעות בטמפרטורת החדר, ומחליפים את המים כל 30 עד 60 דקות. המשיכו לשטוף את הרשתית במים למשך הלילה בניעור עדין בטמפרטורת החדר למחרת, הסירו את המים וב-3% טריפסין, בדקו במיקרוסקופ כדי לוודא שלא נמצא פסולת בבאר. כדי להימנע מהידבקות של כלי הדם אליו, יש לדגור על הרקמה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם ניעור עדין או ללא ניעור למשך שעה עד שעה וחצי.
כאשר הרקמה מתחילה להראות סימני התפוררות, הנח את הצלחת על שלב המיקרוסקופ ולאחר מכן הימנע מהרשתית. הסר בזהירות את הטריפסין כדי להפריד את כלי הדם. ראשית, הוסף מים מסוננים לרשתית באמצעות מלקחיים.
מקלפים את הממברנה המגבילה הפנימית, הנראית כשכבה דקה ושקופה. לנער את הצלחת בתסיסה קלה. לאחר חמש דקות, הניחו את הצלחת שוב על במת המיקרוסקופ והחליפו בזהירות את המים, תוך הימנעות מנזק לרשתית כדי לסייע בשחרור רשת הכלים מרקמת הרשתית הדביקה.
שטפו את הרשתית כפי שהודגם זה עתה עד שלא נשאר מעט פסולת במים לאחר הכביסה האחרונה. אז בדרך כלל הסרת כל הרקמות הלא וסקולריות היא החלק המסובך ביותר בהליך. ניתן להשתמש בטכניקות הבאות ברצף או בנפרד כדי להקל על בידוד רשת כלי הדם, טיפ חשוב אחד הוא לטבול את כל הכלים והטריפסין לפני מניפולציה של הרשתית.
זה יכול לעזור למנוע היצמדות של רקמה לציוד. צפו קצה מיקרו פיפטה בנפח 200 מיקרוליטר בטריפסין שמור, ולאחר מכן פזרו בזהירות מים למעלה ולמטה, צמודים ונושבים לכיוון כלי הרשתית, וגורמים לתסיסה עדינה. אם הרקמה הלא וסקולרית עדיין עמידה במרכז, מיקרו פיפטה מצופה טריפסין קצה בעצב הראייה ופיפטה בזהירות את כל רשת כלי הדם למעלה ולמטה כדי לסייע בפירוק הרקמה הלא וסקולרית.
לבסוף, בסדר. ניתן להשתמש במלקחיים כדי להרים בעדינות את כלי הדם מהמים כדי לעקור את כל הרכיבים שאינם כלי דם. התוצאה הסופית צריכה להיות רשת כלי דם ברשתית ללא פסולת שלמה.
כדי לדמיין את כלי הדם, הניחו תחילה טיפת מים על מגלשה נקייה. לאחר מכן העבירו את הכלים המעוכלים למים תחת בדיקת היקף. אם תושבת דש ה-VA מקופלת או נפרשת, כלים מקופלים מובילים לראות לקויה.
כאשר הוא מוכתם, אם הרקמה מקופלת, הוסיפו מים נוספים ונערו בעדינות את השקופית כדי להקל על הפתיחה. לאחר מכן השתמש במיקרו פיפטה כדי להסיר לאט את עודפי המים. התוצר הסופי של הליך מוצלח הוא הרכבה שטוחה של כל רשת כלי הדם ברשתית העכבר עם הארכיטקטורה שנשמרת ומוכתמת בהמט, טואין ואואין.
כפי שמוצג כאן, כפי שניתן לראות בתמונה זו, ניתן לראות בידול ברור בין תאי האנדותל לפריציטים ברשתית. גרעיני תאי האנדותל כפי שמצוין על ידי החץ הלבן, הם סגלגלים או מוארכים ושוכנים לחלוטין בתוך דופן כלי הדם. גרעיני הטפיל מסומנים על ידי החץ השחור הם כתם כדורי קטן וצפוף, ובדרך כלל יש להם מיקום בולט לאורך דופן הנימים.
טריפסין ועיכול הוא הליך נפוץ המשמש לניתוח פתולוגיה של כלי הדם במודלים של בעלי חיים סוכרתיים. תמונה זו מציגה דוגמה לניוון נימי כפי שמצוין על ידי החץ הלבן כפי שנצפה בעכבר DB DB, מודל לסוכרת מסוג 2. למרות שהליך זה עבר אופטימיזציה עבור רשתית עכברים, ניתן להשיג תוצאות דומות גם ברשתית של חולדות.
חשוב לציין כי רשתית החולדה כפי שמוצג בתמונות אלה, גדולה יותר מרשתית העכבר ודורשת 12 ולא 24 בעוד צלחות. רשת כלי הדם של רשתית החולדה גם פחות שבירה ממקבילתה העכברים. זה חיוני ביותר להסיר כמה שיותר מהרקמה הלא וסקולרית.
כל שאריות יובילו לצביעה לא ספציפית ויובילו להדמיה לקויה של כלי הדם. בתמונה זו, למשל, ניתן להבחין בהסרה לא מוצלחת של כל הרקמה הלא וסקולרית. כמו כן, חשוב גם לפרוש את הרשתית בעת ההרכבה כדי לשפר את ההדמיה של כלי הדם.
תמונה זו מציגה התפתחות לא מוצלחת של התושבת השטוחה של כלי הדם. לאחר שליטה בהליך הקשה מבחינה טכנית זה. טיולים ועיכולים יכולים להיות שיטה בעלת ערך רב המאפשרת הדמיה מפורטת של כל רשת כלי הדם.
על ידי שיפור הטכניקה הזו בעין העכבר, חוקרים יכולים לנצל עכברים שעברו מניפולציה גנטית כדי לחקור מסלולים שונים שיכולים להשתלט על כלי הדם ברשתית ולאפשר לנו להבין את הפתופיזיולוגיה של מחלות רשתית שונות. כתוצאה מכך, אנו יכולים לשפר את ההבנה שלנו לגבי פתולוגיות של מחלות כמו רטינופתיה סוכרתית. על ידי חקר מודלים של עכברים כמו עכבר ה-DVDB, זה יכול בסופו של דבר לאפשר את ההזדמנות למצוא התערבויות טיפוליות פוטנציאליות חדשות המכוונות לכלי הדם ברשתית.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
כתב יד זה מפרט את שיטת העיכול בטריפסין לניתוח של כלי הדם ברשתית, תוך דגש על אופטימיזציות מרכזיות לשיפור הטכניקה. התהליך מבודד ביעילות את הרשת הvסקולרית תוך שימור ארכיטקטורת כלי הדם.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביולוגיה של הרשתית
- ניתוח כלי דם
רקע
- ניתוח של כלי הדם ברשתית הוא חיוני להבנת פתולוגיות שונות.
- שיטות מסורתיות עשויות שלא לספק ויזואליזציה ברורה של כל הרשת הוורידית.
- עיכול באמצעות טריפסין מציע גישה מעודנת לבידוד ולהדמיה של כלי הדם ברשתית.
- שיטה זו מאפשרת בחינה של שינויים פתולוגיים במערכת כלי הדם.
מטרת המחקר
- לתיאור מפורט של שיטת העיכול באמצעות טריפסין.
- לאופטימיזציה של הטכניקה להשגת בהירות גבוהה יותר בהדמיית כלי דם.
- להדגמת היתרונות של שיטה זו לעומת טכניקות קיימות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- רשתית מבודדת עוברת סדרה של שטיפות במים.
- עיכול ב-trypsin בטמפרטורה של 37 °C למשך 1-1.5 שעות.
- בידוד של מערכת כלי הדם באמצעות שטיפות נוספות והפרידה (dissection).
- הדמיה של שינויים פתולוגיים תחת מיקרוסקופ.
תוצאות עיקריות
- ניתן להדגיש בבירור את כל רשת כלי הדם ברשתית.
- ניתן להבחין בשינויים פתולוגיים כגון מיקרו-אנוריזמות ודגרנציה של נימי הדם.
- השיטה מספקת יתרון משמעותי על פני דגימות רשתית שטוחות (retinal flat mounts).
- בהירות משופרת מאפשרת ניתוח טוב יותר של מצבים וסקולריים.
מסקנות
- עיכול באמצעות טריפסין הוא שיטה יעילה לניתוח כלי דם ברשתית.
- אופטימיזציות משפרות את הבהירות ואת רמת הפירוט של ויזואליזציית כלי הדם.
- טכניקה זו יכולה לסייע בחקר פתולוגיות שונות של הרשתית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית להנהלה
ויזואליזציה חזקה של כלי הדם ברשתית במודלים של עכברים מהונדסים גנטית היא קריטית לתיקוף מטרות בשלבים מוקדמים ולהפחתת סיכונים מכניסטיים בגילוי תרופות אופתלמולוגיות. פרוטוקול העיכול באמצעות טריפסין מאפשר הערכה כמותית ברזולוציה גבוהה של פתולוגיה וסקולרית, ובכך תומך בביטחון ניבוי במערכות רלוונטיות למחלה. יכולת זו חיונית למיון פורטפוליו וקידום מחקר תרגומי במחלות וסקולריות של הרשתית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיקה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה ישירה של פתולוגיה וסקולרית במודלים של עכברים שעברו שינוי גנטי.
- תומך בתיקוף תפקודי של יעדים באמצעות כימות מיקרו-אנוריזמות, דגנרציה של נימים ויחסי תאים.
- מסייע בהפחתת סיכונים מנגנוניים על ידי בידוד פנוטיפים ספציפיים לכלי הדם מרקמת רשתית המהווה גורם מתערב.
- משפר את רמת הביטחון החזויה לבדיקת היפותזות טיפוליות בהמשך.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק זרימת עבודה (workflow) מתוקפת להכנת רשתות כלי דם שלמות לצורך ניתוח כמותי.
- מנstandard את הכנת הדגימות, ובכך משפר את השחזוריות ואת היכולת להשוות בין בדיקות במחקרים שונים.
- מאפשר זיהוי מהימן של שינויים וסקולריים עדינים לצורך סריקת תרכובות במודלים של מחלות.
- תומך ביכולת הרחבה (scalability) ובשימוש חוזר בפלטפורמה בתוכניות פרה-קליניות של ביולוגיה וסקולרית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם נקודות סיום רלוונטיות למחלה עבור רטינופתיה סוכרתית והפרעות וסקולריות רטינליות אחרות.
- מבטיח רצף מהנדסה גנטית ועד לקריאה פנוטיפית במודלים פרה-קליניים.
- מפחית את הסיכון התרגומי על ידי אספקת ביומרקרים כמותיים וספציפיים לפתולוגיה.
- מאפשר קבלת החלטאות על קידום מותאם סיכון המבוסס על פנוטיפ וסקולרי חסון.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
פרוטוקול העיכול באמצעות טריפסין משתלב ברצף הגילוי, החל מתיקוף מטרות מוקדם ועד לאפיון מודלים פרה-קליניים, ובכך תומך בתהליכי עבודה של סריקה פנוטיפית ובכאלו המונחים על ידי היפותזה.
- ביולוגיה של הגילוי: מאפשרת בדיקה של השערת האפס על ידי בידוד השפעות וסקולריות מרכיבים רטינליים שאינם וסקולריים.
- סינון: מספקת תוצרים כמותיים הניתנים לשחזור לצורך השוואה בין מחקרים והערכת תרכובות.
- אנליזה: מאפשרת מדידה של יחסים בין תאי אנדותל לפריציטים וזיהוי של נגעים וסקולריים.
- מחקר תרגומי: מספקת פנוטיפים רלוונטיים למחלה לצורך התאמת סמנים ביולוגיים במודלים של רטינופתיה סוכרתית.
- שימוש חוזר ארגוני: קובעת פרוטוקול סטנדרטי וניתן לשימוש חוזר לאנליזה וסקולרית במגוון שורות עכברים שעברו הנדסה גנטית.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרי כלי דם ברשתית.
- ערך תפעולי: משפר את השחזור, הסטנדרטיזציה והסקליביליות של תהליכי עבודה לפנוטיפינג כלי דם.
- ערך אסטרטגי: תומך בקבלת החלטות מושכלת של go/no-go ובניהול פורטפוליו יעיל מבחינת הון.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכונים של מטרות ומודלים בהתבסס על נקודות סיום כלי דם חסונות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות טכנית במיקרודיסקציה וטיפול ברקמות להשגת תוצאות עקביות.
- מחייב גישה לתשתית של מיקרוסקופיה וצביעה היסטולוגית לצורך ניתוח נקודות הסיום.
- דורש סטנדרטיזציה קפדנית בין צוותים כדי להבטיח הדירות של המחקרים.
- עשוי לדרוש התאמה למינים שונים או לגדלי רשתית שונים, כפי שצוין עבור מודלים של חולדה לעומת עכבר.
- הסרה חלקית של רקמה לא-כליות עלולה לפגוע באיכות הנתונים ובויזואליזציה.
