בידוד של hepatocytes האנושי על ידי שני שלבים Collagenase זלוף נוהל

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד הפטוציטים אנושיים באמצעות הליך זלוף קולגנאז דו-שלבי. זה מושג על ידי קנולציה ראשונה של כלי הדם בחתיכת כבד עם צינורית השקיה. לאחר מכן הזלוף והעיכול של חתיכת הכבד באמצעות קולגנאז.

השלב השלישי הוא הסרת קפסולת הגליץ, המשחררת את תאי הכבד המנותקים. השלב האחרון הוא צנטריפוגה במהירות נמוכה המבודדת הפטוציטים. בסופו של דבר, ניתן לזהות הפטוציטים באמצעות מיקרוסקופ ניגוד פאזה או על ידי צביעת אלבומין באמצעות כימיה חיסונית ציטו עם כדאיות ותפוקה של הפטוציטים שנקבעו באמצעות בדיקת אי הכללה כחולה טריאם.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד את שלבי הקנולציה והעיכול. הסיבה לכך היא שקנולציה דורשת עדינות מסוימת והשלמת העיכול יכולה להיות קשה לזיהוי. לאנשים חדשים בטכניקה, תדגים את ההליך נטלי לון, טכנאית מהמעבדה שלי.

בהדגמה זו, נשתמש בחתיכת כבד מנורה במקום חתיכה מאדם, נדאג להגדיר את הציוד לזלוף חתיכת הכבד באופן הבא, לכוון את אמבט המים לטמפרטורה מתאימה כך שהתמיסות יהיו 37 מעלות צלזיוס כאשר הן מגיעות לכבד. חתיכה. 41 מעלות צלזיוס טובות לפתרונות 1, 2 ו-3, ועבור תמיסת מעבה הזכוכית המעוטפת 4, לעומת זאת, צריכות להיות ב-37 מעלות צלזיוס כדי להפחית את אובדן פעילות הקולגנאז. זמן קצר לפני השפע הפעל את ווסת הגז עבור מנגנון החמצון מפתולוג, השג חתיכת כבד שבאופן אידיאלי יש בה קפסולת נוצץ שלמה ברובה או מלאה ורק מקום משטח חתוך אחד.

חתיכת הכבד הזו על משפך בוכנר המכילה דיסק פילטר מחורר, כעת יש לטפל במערכת הזלוף בתמיסה אחת באמצעות צינורית השקיה מעוקלת בקצב זרימה נמוך עם קצות זיתים לכלי הדם הגדולים יותר על פני השטח החתוך של חתיכת הכבד. כאשר הדם נשטף החוצה מהכבד, הרקמה הופכת קלה יותר באזורים עם זלוף טוב. מספר הצינוריות בשימוש משתנה עבור כבדים בגדלים שונים.

באופן כללי, יש להשתמש בארבע עד שמונה צינוריות לכבדים הנעים בין מתחת ל-20 גרם ליותר מ-80 גרם. בחר את מד הצינורית להתאמה צמודה ובטוחה. השאירו את כלי הדם הקטנים יותר פתוחים כדי שהמאגר יתנקז החוצה מהרקמה.

כעת, הגדל את קצב הזרימה במשאבה הפריסטלטית בין 110 ל -460 מיליליטר לדקה. זהו זלוף טוב אם חתיכת הכבד היא בצבע בהיר יותר לאורך קצב הזרימה המשמש. תלוי בגודל הכבד עם שיעורי זלוף גבוהים יותר המשמשים לכבדים גדולים יותר.

באופן כללי, מהירות זלוף ממוצעת של 44 מיליליטר לדקה לכל צינורית היא אידיאלית על פני מגוון משקלי כבד שונים. קצב הזרימה שנבחר אמור לגרום להתנפחות קלה של חתיכת הכבד. שמור על חתיכת הכבד לחה במהלך הזלוף על ידי כיסויה בחתיכת גזה ספוגה במי מלח.

לאחר החדרת הרקמה עם ליטר אחד של תמיסה, אחת כדי לשטוף את כל הדם שנותר בחתיכת הכבד. החלף את נוזל הזלוף לתמיסה שתיים והחדיר למשך 10 דקות. לאחר מכן, העבר את נוזל הזלוף לתמיסה שלוש והחדיר עם חצי ליטר.

כעת החלף את נוזל הזלוף לתמיסה ארבע, המכילה קולגנאז. בצע את הזלוף הזה בצורה מחזורית במשך תשע עד 12 דקות או עד שהכבד מתעכל מספיק. רקמת הכבד אמורה להיראות כאילו היא מתפרקת מעט מתחת לקפסולה הנוצצת.

הכבד אמור גם להרגיש מתרכך כאשר בודקים אותו עם הצד הקהה של אזמל. חשוב לעכל את חתיכת הכבד למשך הזמן הנכון מכיוון שעיכול יתר יכול להוביל לכדאיות נמוכה של הפטוציטים ולעיכול נמוך יכול להוביל לתפוקה נמוכה של הפטוציטים. התחל בכיבוי המשאבה הפריסטלטית והוצאת הצינורית מחתיכת הכבד.

לאחר מכן מניחים את הרקמה בכלי מתגבש המכיל 100 עד 200 מיליליטר תמיסה. חמש. הסר את כמוסת הנוצץ בזהירות ונער בעדינות את התאים. אם ישנם אזורים שאינם חדורים היטב, ניתן להשתמש באזמל כדי לחתוך את האזורים הללו כדי לשחרר תאים הכלולים בהם.

הוסף עוד פתרון חמש לפי הצורך במהלך התהליך, ובסופו של דבר הביא את נפח התמיסה לחמישה עד 500 מיליליטר. כעת סנן את מתלה התאים פעמיים. ראשית, סנן את התאים דרך רשת ניילון של 210 מיקרון לבקבוק חרוטי של ליטר אחד.

לאחר מכן מסננים את התאים דרך רשת ניילון של 70 מיקרון לבקבוק חרוטי של ליטר אחד. שופכים שני נפחים שווים של מתלה התא לצינורות צנטריפוגה של 200 מיליליטר. לאחר מכן צנטריפוגה של מתלה התא המסונן ב-72 Gs למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.

שאפו את החטף והשעו בעדינות את כדור התא בכ-200 מיליליטר תמיסה. חמש. חזור על תרחיף הצנטריפוגה וההחייאה שלוש פעמים לאחר הצנטריפוגה הסופית, השהה מחדש את התאים בתמיסת אחסון קר לריכוז סופי של שניים עד 5 מיליון הפטוציטים למיליליטר. ניתן להשתמש בבדיקת טריאם כחול כדי למדוד במדויק את ספירת התאים באמצעות ציטומטר המו.

מוצגים כאן הפטוציטים מוכתמים בכחול טריאן מ-648 בידודים. הכדאיות הממוצעת של הפטוציטים אנושיים מבודדים הייתה 77 פלוס מינוס 10%התפוקה הממוצעת של הפטוציטים הייתה 13 פלוס מינוס 11 מיליון הפטוציטים לגרם כבד באמצעות אימונופלואורסצנטי. הפטוציטים מבודדים שנצבעו באופן חיובי עבור אלבומין בירוק היו בעלי טוהר של 94 פלוס מינוס 1% כדי לקבוע את טוהר הפטוציטים.

צביעה אימונו-פלואורסצנטית בוצעה ארבע פעמים עם חמישה שכפולים בכל ניסוי. מיקרוסקופ ניגודיות פאזה מראה את המאפיינים המורפולוגיים של הפטוציטים כגון גודל התא הגדול שלהם וצורתם המצולעת. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד הפטוציטים אנושיים באמצעות הליך זלוף קולגנאז דו-שלבי.