הקמתה של במבחנה מערכת ללמוד את התנהגות תאית של קנדידה glabrata בהמקרופאגים THP-1 אדם

המטרה הכוללת של הליך זה היא להקים מערכת מודל תרבית חוץ גופית לחקר התנהגות תוך-תאית של פתוגן פטרייתי אופורטוניסטי אנושי. ראטה מעבדה קנדית במקרופאגים שמקורם בקו תאים מונוציטים אנושיים TP אחד. כדי להשיג THP זה, מונוציטים אחד מטופלים תחילה בארבעה אסטרים כדי להבדיל אותם למקרופאגים.

לאחר מכן, THP אחד מקרופאגים נגועים בתאי GTA קנדיים שעתיים לאחר ההדבקה. תאי GTA שאינם פגוציטוז קנידה מוסרים על ידי מנקי PBS ותאי e תוך-תאיים משוחזרים למחקרים נוספים על ידי אוסמוס של מקרופאגים נגועים. ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי להעריך הן את תאי ה-GTA הוויראליים לקנידים במקרופאגים והן את תגובת רוס התבגרות הפאיז והציטוקינים ב-THP ב-FIDS מאקרו לאחר זיהום קנדידה GTA.

בנוסף, ניתן להגדיל פרוטוקול זה כדי לסנן את ספריית המוטאנטים של משתף הפעולה עם הקנדידה עבור פרופילי הישרדות משתנים במקרופאגים של TSP אחד באופן תפוקה גבוהה למחצה. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא שהוא זול יחסית, ניתן לשחזור מאוד וניתן להתאמה בקלות לתאי חיסון שונים כמו גם לפתוגנים פטרייתיים. כדי להתחיל את ההליך יומיים לפני ההדבקה, הביא THP ותאים מונוציטים ל-80% CO ביום הראשון, הסר את סיכון התרבית ולאט לאט ובעדינות להביא את כל התאים העדינים לתרחיף.

העבירו את תרחיף תא המונוציט האחד של DHP לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל. צנטריפוגה תרחיף התא בטמפרטורת החדר למשך ארבע דקות ב 1000 סל"ד דקן את המדיום לתוך מיכל פסולת בחמישה מ"ל לפני מדיום API לתוך הצינור וראוס. השעו את כדור ה-THV של תא אחד על ידי פיפטינג עדין של המדיום שלוש ארבע פעמים.

קח 10 מיקרוליטר של תרחיף התא כדי לקבוע את צפיפות התאים באמצעות ציטומטר המו והתאם את צפיפות התאים למיליון תאים למ"ל. הוסף מיקרוליטר אחד של תמיסת מלאי PMA אחת של 60 מיקרומולרית לתרחיף התאים כך שהריכוז הסופי יהיה 16 אנו מולר וערבב אותו היטב. הוצא תרחיף תאים אחד מ"ל המתאים למיליון תאים לכל באר של צלחת תרבית רקמה של 24 בארות והעביר אותו לאינקובטור המוגדר ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2.

לאחר 12 שעות דגירה, השליכו את המדיום הישן. מוסיפים מ"ל אחד של מדיום קדם RPI לכל באר ומדגרים את הצלחת למשך 12 שעות נוספות. תאים אלה ישמשו לזיהום בקנדה, שיוצג בהמשך.

באמצעות שיטות מיקרוביולוגיות נכונות יש לחסן מושבת EA בודדת לתוך מדיום ML YPD. דגרו את הפלאס למשך 14 עד 16 שעות באינקובטור המוגדר ל-30 מעלות צלזיוס לאחר צנטריפוגת הדגירה. תרבית ML אחת ב-4,000 סל"ד למשך חמש דקות.

השליכו את ה-sup natin ושטפו את הקונכיות שלוש פעמים עם PBS סטרילי. לאחר השלכת מאגר הכביסה, השעו את פלטת התאים ב-PBS סטרילי של מ"ל אחד על ידי פיפטינג עדין. לאחר מכן, מדוד את הספיגה של תרחיף התאים בפוטומטר ספקטרו ב-600 ננומטר והתאם את צפיפות התא ל-2 מיליון תאים למ"ל באמצעות PBS.

קח 50 מיקרוליטר מתרחיף התא ודלל פי מאה בצלחת PBS מאה תרבית מיקרוליטר על מדיום YPD AGA. דגרו את הצלחת ב-30 מעלות צלזיוס וספרו את מספר המושבות שהופיעו על צלחת YPD לאחר יום או יומיים, הכפילו את המספר הזה במקדם דילול מתאים כדי לחשב יחידות יצירת מושבה של אפס שעות. היחידות הרבות הללו שיוצרות מושבות של קנדה רטה ישמשו להדבקת DHE במקרופאגים.

בשלב הבא, הוסף תרחיף תאי קלטר של 50 ליטר מאקרו קנדה לשכבת מונו מקרופאג בצלחת תרבית של 24 לווייתנים. אדמו את הצלחת כדי לפזר באופן שווה כל תא ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לאחר שעתיים דגירה. השליכו את המדיום על ידי היפוך צלחת התרבות למיכל לכל באר של התרבות צלחת ב-PBS סדרתי מ"ל בזהירות לאורך צד בארות הבאר ביסודיות והשליכו את המאגר.

חזור על שלב זה פעמיים נוספות. לאחר מכן, מלבד הבאר הראשונה, הוסף מדיום ML RPI אחד לכל הבארות האחרות, שניתן להשתמש בו כדי לנטר שכפול תוך-תאי של תאי קנדידה ב-4, 6, 12 ו-24 שעות לאחר ההדבקה כדי לשחזר תאי e תוך-תאיים לאחר שעתיים של זיהום במקרופאגים, הוסף מי דגנים ML אחד לפוס. ובכן לאחר שתי דקות, מגרדים את הבאר בעדינות עם קצה הפייפר ML אחד כדי להסיר את פסולת המקרופאגים של הבאר.

שוטפים את הבאר ואוספים אותה בצינור דג מאקרו צנטרי. הכן דילול פי מאה של ליזאט תאי microFIT ב- PBS וצלחת מאה מיקרוליטר על מדיום YPD AGA. דגרו על הצלחת בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך יום עד יומיים וספרו את מספר היחידות היוצרות מושבה.

הכפל את המספר הזה במקדם דילול מתאים כדי לספור את מספר תאי ה-canida ator שהם פגוציטוז ב-T שתיים ומקרופאגים לאחר הדבקה של שעתיים. באופן דומה, ניתן לקבוע את מספר תאי הקנידה התוך-תאיים בנקודות זמן שונות. ניתן לייצג לאחר הדבקה ושכפול תוך תאי כעלייה ב-24 שעות בהשוואה ל-CFUs שהופנמו בשעתיים המוצגות כאן.

תוצאות אחרות של ניסוי טיפוסי שבו המספר הכולל של תאי גטור קנדיים הנגועים במקרופאגים בטלוויזיה הוא שש כפול 10, שניים לארבעה. מספר התאים ששוחזרו בשעתיים הוא 3.7, שש כפול 10.4. בכך ממחיש שתאי e עוברים פגוציטוזציה בשיעור של 62.66% במהלך תקופת הדגירה המשותפת של 24 שעות.

האם תאים יכולים מלבד שכפול פי 5.2 כאשר מספר תאי ה-e התוך-תאיים גדל מ-3.76 כפול 10.4 ל-1.96 כפול 10.5. בניסוי זה, ניתן להעריך שכפול תוך-תאי של תאי TER קנידים גם באמצעות תאי GFP המבטאים תאי E תוך מיקרוסקופ קונפוקלי לשם כך. הכן והדביק THV ומקרופאגים בשקופית של ארבעה חדרים באמצעות הפרוטוקול שתואר קודם לכן עבור צלחת תרבית 24 בארות.

שעתיים לאחר ההדבקה. השלך את המדיום על ידי היפוך השקופית למיכל פסולת ב-500 מיקרוליטר PBS לכל תא של המגלשה. שוטפים היטב וזורקים PBS.

חזור על שלב זה פעמיים נוספות ב-500 מיקרוליטר של 3.7% גובה פורמלי כדי לתקן את התאים. דגרו את המגלשה בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות והשליכו את הגובה הרשמי. שטפו כל מחיר באר עם 500 מיקרוליטר PBS כדי לגייס מקרופאגים ב-500 מיקרוליטר טריטון X לאחר חמש דקות דגירה, הסירו את טריטון X שטפו את מכת הבאר עם PBS.

לפרק בזהירות את מגלשת החדר באמצעות הסרת תא ומגלשת רוכב אוויר. הנח טיפה אחת של מדיום הרכבה וקטורי Shield המכיל DPI על כל מגזר של השקופיות, התקן החלקת כיסוי ואטום את הקצוות בתאים חזותיים בצבע ציפורניים תחת מיקרוסקופ קונפוקלי. מוצגות כאן התמונות הקונפוקליות המייצגות של מקרופאגים מסוג TP אחד הנגועים ב-GFE המבטאים תאי מעבדה קנדיים מסוג בר בערך פי שישה עלייה במספר תאי ה-e התוך-תאיים משעתיים ל-24 שעות מעידה על שכפול מעבדה של קנידה בגישת מוטגנזה של תג חתימה של מקרופאגים TP נמצאת בשימוש נרחב לזיהוי גורמי אולנס בפתוגנים מיקרוביאליים שבהם מספר רב של מוטציות נבדקות בו זמנית לאיתור פגמי גדילה באמצעות אוליגונוקלאוטיד ייחודי תג רצף.

כאן אנו מתארים את הפרוטוקול שלנו עבור מסך STM של ספריית קנדה וספריית המוטאנטים, המורכב משלושה שלבים הבאים. 96 הפלסמידים הראשונים. כל אחד מהם מכיל ערימת רצף אוליגונוקלאוטידים ייחודית משותקים על קרום ניילון.

בשלב השני, מאגר של 96 מוטציות CANIDA ator נבדק עבור פרופילי הישרדות משתנים במקרופאגים THV one, ואחריו התאוששות של YPD, תאי e מוטנטיים שגדלו ומקרופאגים מופנמים, אשר יכונו דגימות קלט ופלט בהתאמה. לבסוף, תגי חתימת DNA מוגברים PCI ותווית רדיו מדגימות DNA גנומיות קלט ופלט. מוצר ה-PCR עובר הכלאה לתגים ייחודיים ואותות רדיואקטיביים על הממברנה מכומתים ומנותחים.

כדי להרכיב את מנגנון לוח 96 12 הנקודות, הנח קרום ניילון רטוב על גבי נייר עץ רוח להחלפה לח והדק את הברגים של היחידה. שוטפים את הממברנה במים סטריליים, ואחריהם שטיפה עם 0.4 מו נתרן הידרוקסיד. העבר 200 ננוגרם של תמיסת PLA BDNA מהבלוק 96 12 לבארות המתאימות של אפטוס הדם הנקודתי לאחר שטיפת נתרן הידרוקסיד 0.4 מולארי.

הסר את הממברנה ממנגנון הדם הנקודתי לאחר פרנס בשני XXSC החוצים את ה-BDNA של הפלזמה המועברת לממברנה בקישור צולב UV. דגירה של הממברנה באנטנות טרום הכלאה, חיץ וקלט ובקבוקי UNE למשך שעתיים ב-42 מעלות צלזיוס. הכן בדיקות רמת רדיו על ידי PCR באמצעות DNA גנומי המופק מפלטות תאי קלט ופלט ופריימרים כנגד אזור האגף ההפוך של תגים ייחודיים.

דנטורציה של תווית הרדיו בודקת ב-99 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות ומצמיד ג'ל לקרח. העבירו את בדיקות ה-de לבקבוקי קלט ופלט ודגרו במשך 14 עד 16 שעות בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס. לאחר הכלאה.

שטפו את ממברנות הקלט והפלט כמתואר בפרוטוקול. הוציאו את הממברנות מהבקבוקים יבשו באוויר וחשפו אותן למסך תמונות פוספו. לאחר שעתיים-שלוש, סרוק את מסך הזרחן ורכוש תמונות.

בדוגמה זו, מוצגים שני מסנני ממברנה היברידיים, המייצגים סינון של מאגר אחד של 96 מוטציות גטוריות קנדיות להישרדות משתנה. במקרופאגים אחד, כימות וקביעת היחס בין עוצמת האות של כל נקודה בפלט לקרום הקלט גילו שמספרי התגים 13, 26, 75 ו-85 אינם מיוצגים בפלט. ערימות אלה מוקפות באדום ומשקפות את צמיחתם של ארבעה מוטאנטים שונים.

לעומת זאת, מוטאנטים נערמים עם רצפים ייחודיים 11 ו-81 המודגשים בירוק מיוצגים יתר על המידה בדגימת הפלט. במילים אחרות, ממסך זה, מאגר של 96 מוטאנטים, שני מוטאנטים אמורים להגדיל את ההישרדות בעוד שארבעה מוטאנטים מופיעים בגדילה במקרופאגים. יש לאמת את פנוטיפים ההישרדות שהשתנו שזוהו במסך בריכה כזה במבחני זיהום בודדים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד לחוקק ומערכת הפה במבחנה לחקור פרופיל גידול תוך-גומי של הפתוגן הפטרייתי שמעניין אותך. בנוסף, אתה אמור להיות מסוגל לבצע סינון מאגר מוטאנטים בקנה מידה גדול באמצעות המערכת כעת.