שיטה לCulturing עוברי ג elegans תאים
21 בספטמבר 2013
אנו מתארים כאן פרוטוקול מתוקן לתרבות בקנה מידה גדולה של ג העוברי elegans תאים. עוברי ג elegans תאים בתרבית במבחנה באמצעות שיטה זו, מופיעים כדי לבדל ולשחזר את הביטוי של גנים באופן ספציפי בתא. טכניקות הדורשות גישה ישירה לתאים או בידוד של סוגי תאים ספציפיים מרקמות האחרות יכולות להיות מיושמות על ג elegans תאים בתרבית.
המטרה הכוללת של הליך זה היא להפריד ולתרבית תאים אלגנטיים במבחנה, עובריים. זה מושג על ידי גידול כמויות גדולות של חיות קבר. הביצים הבאות מבודדות ממבוגרים.
לאחר מכן מטפלים בביצים בצ'יטינאז כדי להמיס את קליפת הביצה. לבסוף, התאים מנותקים ידנית ומצופים לתרבות. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות ביטוי של סמנים ספציפיים לתא באמצעות טכניקות אימונופלואורסצנטיות, מיקרוסקופיה, אלקטרופיזיולוגיה והדמיית סידן.
הדגמה של ההליך תהיה rel ti, מעבדה פוסט-דוקטורנטית. לאחר טיפוח לפחות ארבע צלחות של אלגנטיות ים לשלב המבוגרים של GR והכנת מדיה ופתרונות לפי פרוטוקול הטקסט. התחל בבידוד הביציות על ידי הוצאת שפופרת של תמיסת מלאי לקטין בוטנים שהוכנה בעבר.
מניחים פתקי כיסוי חיטוי בבארות של צלחת 24 בארות ומוסיפים 200 מיקרוליטר לקטין בוטנים לכל החלקת כיסוי לדגור למשך שעה לפחות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שאפו את התמיסה והשתמשו במים סטריליים לשטיפת הבארות. לאחר הסרת כל עקבות לקטין בוטנים כדי למנוע גוש תאים.
לאחר מכן בעזרת מי חיטוי סטריליים, שטפו את מבוגרים ה- GR מלוחות האגר ואספו את המתלה בשני צינורות חרוטיים סטריליים של 50 מיליליטר. הניחו את הצינורות על קרח למשך עד חמש דקות כדי לאפשר לתולעים להתיישב לתחתית בעזרת פיפטת העברה, הסר את המים והחלף אותם בצנטריפוגת מים טרייה וסטרילית. התולעים ב -200 גרם למשך 10 דקות.
לאחר הכביסה האחרונה, החייאה, השעו את התולעים במים סטריליים טריים והעבירו אותן לצינור חרוטי סטרילי של 15 מיליליטר לפני שמסתובבים שוב ב -200 גרם למשך 10 דקות. אם התולעים אינן גלוליות לחלוטין, הניחו את הצינור על קרח למשך חמש דקות. לאחר שהתולעים התייצבו לחלוטין, הסר את המים והוסף חמישה עד שישה מיליליטר של תמיסת ליזה.
לאחר מכן נדנד בעדינות את המתלה למשך חמש עד 10 דקות וכל שתיים-שלוש דקות, הנח טיפת מתלה על החלקת כיסוי ובדוק אם יש ליזה תחת מיקרוסקופ סטריאו. כאשר 72-80% מהתולעים עוברות ליזה, עצרו את תגובת הליזיס על ידי הוספת תשעה מיליליטר של מאגר ביצים לפני הסיבוב מנקודה זו והלאה, הדליקו מבער בונסן והשאירו אותו דולק כדי למנוע זיהום חוזר של הביצים, הסירו בזהירות את הסופרנטנט והשתמשו במאגר ביצים כדי לשטוף היטב את הגלולה שלוש עד ארבע פעמים עד שהתמיסה צלולה. לאחר מכן, לאחר הסרת הסופרנטנט הסופי כדי להפריד את הביצים מהרסוס פגרי בעלי החיים, השעו את הגלולה בשני מיליליטר של מאגר ביצים סטרילי והוסיפו שני מיליליטר של 60% סוכרוז במאגר הביצים.
מערבבים היטב את הביצים בתמיסה לפני הצנטריפוגה למשך 20 דקות. בטמפרטורה של 200 גרם, הסר בזהירות את הצינורות מהצנטריפוגה. הביצים יצופו בחלק העליון של התמיסה.
לכן, השתמש בצינור ובקצות מיליליטר סטרילי כדי להעביר את הביצים לצינור חרוטי טרי של 15 מיליליטר. השתמש במאגר ביצים סטרילי כדי לשטוף את הביצים שלוש פעמים תוך כדי עבודה מתחת למכסה המנוע הלמינר. כדי להימנע מהכנסת זיהום חיידקי, החייאה, השעו את הביצים הגלוליות במיליליטר אחד של שני מיליגרם למיליליטר קינאז והעבירו אותן לצינור חרוטי טרי של 15 מיליליטר.
נדנד את הצינור למשך 10 עד 30 דקות בטמפרטורת החדר, תלוי בטריות האנזים כאשר כ -80% מקליפות הביצה מתעכלות. צנטריפוגה את הביצים בחום של 900 גרם למשך שלוש דקות. לאחר הסרת הסופרנטנט בזהירות, הוסיפו שלושה מיליליטר של L 15 בינוני, העבירו את הביצים לצלחת בקוטר שישה סנטימטרים והתחילו בפירוק ידני באמצעות מזרק סטרילי של 10 מיליליטר עם מחט בגודל 18.
כדי לפקח על מידת הדיסוציאציה, הניחו טיפת תרחיף לתוך צלחת פטרי טרייה וצפו במיקרוסקופ. המשך עד שכ-80% מהתאים מנותקים. כדי להסיר גושי תאים, ביצים לא מעוכלות וזחלים שבקעו, סנן בעדינות את התרחיף דרך מסנן של חמישה מיקרון והעביר ארבעה עד חמישה מיליליטר נוספים של מדיום L 15 דרך המסנן כדי לשחזר את התאים לתרבית התאים.
לאחר צנטריפוגה של המסנן ב-900 גרם למשך שלוש דקות, החייאת התאים במדיום L 15 שלם שיחקה מיליליטר אחד לבאר ואחסנה צלחות בתא אטום לח ב-20 מעלות צלזיוס באוויר הסביבה. על מנת להבדיל תאי אלגן עובריים מבודדים חייבים להיצמד למצע. תהליך ההתמיינות מתחיל כשעתיים-שלוש לאחר הציפוי ונמשך כ-24 שעות.
המאפיינים המורפולוגיים במבחנה דומים להפליא לאלה in vivo. לדוגמה, כפי שמוצג כאן, נוירוני מגע LM ו-PLM מפתחים רק שני תהליכים עצביים כאשר אחד מהם ארוך יותר מהשני כפי שהם עושים in vivo. זה מצביע על כך שלפחות חלק מהמנגנונים המולקולריים המניעים התמיינות בתאי אלגן הם אוטונומיים של התאים ולכן ניתן לסכם אותם.
ניתן להבחין גם בסמני חלבון במבחנה ושינויים לאחר תרגום שהם ספציפיים לתא במבחנה. לדוגמה, אלפא טובולין הוא נוירונים שבעים רק במגע באלגן הים כפי שמוצג כאן בתהליכי מבחנה של נוירוני מגע מכתימים עם נוגדן מורם כנגד אלפא טובולין שבע. ובנוסף, כפי שניתן לראות בפאנל זה, נוירוני מגע מתורבתים מבטאים את הערוץ המוטנטי הרעיל MEC four D, הגורם למוות של נוירוני מגע in vivo.
נוירונים המבטאים GFP שהוכנו מזן MEC Four DPE 4G FP קיימים בתחילה בתרבית, אך לאחר מכן מתנוונים. עם זאת, בדיוק כמו in vivo, ניתן להציל את התאים ממוות על ידי טיפול ב-IDE ובדנטרולן כפי שמוצג כאן. טכניקות מהדק טלאי משמשות לחקר תעלות אשלגן אוניק, אוניק, לא סלקטיביות ותלויות בטרנספורטר דופמין בתאים מתורבתים של אלגן ים.
בגלל גודלו הקטן של התא, פיפטות זכוכית חייבות להיות בעלות קצה קטן ולאחר מכן חרוט רחב כדי לקזז את התנגדות הקלט המוגברת. בנוסף, הצלחה גדולה יותר מושגת על ידי הפעלת דחף מתח גבוה על כתם הממברנה מתחת לקצה הפיפטה לעומת השגת גישה לתא שלם באמצעות יניקה שעלולה לפגוע בתא. באיור זה כדי לחקור את תפקידן של תעלות סידן מגודרות מתח, ION 4 משמש לחלחל את הממברנה ולכיול נוירוני מגע המבטאים זיקית YC שתי נקודה 12 להדמיית סידן בהיעדר או נוכחות של סידן.
בנוסף, נקבע כי ריכוז הסידן החופשי הממוצע בנוירוני מגע הוא 200 ננו-טוחנת. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד ותרבות מבחנה. ראו אלגנטיות, תאים עובריים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול מעודכן לתרבית רחבה של תאי עובר של C. elegans. השיטה מאפשרת דיפרנציאציה של תאים אלו in vitro, ובכך מאפשרת את חקר ביטוי הגנים באופן ספציפי לתא.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- ביולוגיה התפתחותית
רקע
- C. elegans הוא אורגניזם מודל המשמש באופן נרחב במחקר ביולוגי.
- תאים עובריים יכולים לספק תובנות לגבי תהליכי התפתחות.
- טכניקות של תרבית in vitro משפרות את הנגישות הניסויית.
- ביטוי גנים ספציפי לתא הוא קריטי להבנת תפקודים תאיים.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול מהימן לתרבית של תאי עובר של C. elegans.
- סיוע בחקר ביטוי גנים בסוגי תאים ספציפיים.
- מתן אפשרות ליישום של טכניקות שונות על תאים בתרבית.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בידוד ביצים מ-C. elegans בוגרים.
- טיפול בביצים באמצעות קיטינאז להמסת קליפת הביצה.
- פירוק ידני של תאים לצורך תרבית.
- יישום של טכניקות אימונופלואורסצנציה, מיקרוסקופיה ואלקטרופיזיולוגיה.
תוצאות עיקריות
- דיפרנציאציה מוצלחת של תאי עובר מתורגות של C. elegans.
- שחזור של דפוסי ביטוי גנים באופן ספציפי לתא.
- הדגמה של סממנים ספציפיים לתא באמצעות טכניקות דימות שונות.
- פוטנציאל למחקר נוסף באמצעות תאים מתורגות בתחום מדעי המוח.
מסקנות
- הפרוטוקול המעודכן יעיל לתרבית של תאי עובר של C. elegans.
- שיטה זו פותחת נתיבים חדשים לחקר דיפרנציאציה תאית וביטוי גנים.
- יישומים עתידיים עשויים להעמיק את הבנתנו בביולוגיה התפתחותית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו מאפשרת בידוד ותרבית ניתנים להרחבה של תאי עובר של C. elegans, ובכך מספקת מערכת ניתנת למניפולציה גנטית לצורך תיקוף מטרות בשלבים מוקדמים והפחתת סיכונים מכניסטיים בביולוגיה של מערכת העצבים ובמסלולים התפתחותיים. על ידי תמיכה בהישרדות ובידול ארוכי טווח in vitro, השיטה מקלה על סריקה פנוטיפית הניתנת לשחזור ועל גילוי סמנים ביולוגיים באמצעות אלקטרופיזיולוגיה, דימוג ופרופיל מולקולרי. גישה זו מגבירה את רמת הוודאות החזויית במחקרי מעורבות מטרה (target engagement) על ידי שחזור התנהגויות תאיות וביטוי סמנים דמויי in vivo בפורמט מבוקר התואם לסריקה בתפוקה גבוהה.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות ביטוי סממנים תא-ספציפיים ואנליזה של מסלולים במערכת מוגדרת גנטית.
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות על ידי מתן גישה ישירה לתאים עובריים לצורך פיתוח בדיקות ומחקרי הפרעה.
- ערך תרגומי: מספק מערכת רלוונטית למחלה לצורך חקר מטרות התפתחותיות-עצביות עם מנגנונים מולקולריים שמורים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר תאים עובריים מופרדים המתאימים להכנת מצעים סטנדרטיים לבדיקות אימונופלואורסצנציה, אלקטרופיזיולוגיה ודימויי סידן.
- ערך תפעולי: מאפשר ייצור רב-שלבי של תאים לזריעה בלוחות רב-בארים, ובכך תומך בסטנדרטיזציה ובשחזור של הבדיקות לאורך קמפיינים של סריקה.
- ערך תרגומי: מפיק תאים המבטאים תעלים ונשאים פונקציונליים, המאפשרים קריאות תלויות-ליגנד לצורך זיהוי מולקולות מובילות (lead identification).
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: שומר על נאמנות פנוטיפית למצבים in vivo, מה שמאפשר תצפית על התמיינות אוטונומית של תאים וביטוי סמנים לאורך שבועיים.
- ערך תפעולי: תומך במחקרים אורכיים הדורשים תרביות יציבות לצורך פרופיל תגובה לתרופות התלויה בזמן.
- ערך תרגומי: מגשר בין שלב הגילוי לעבודות פרה-קליניות על ידי אספקת פלטפורמה להפחתת סיכונים של מטרות טיפוליות לפני המעבר למודלים של יונקים.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת ברצף התגליות, החל מיצירת השערות לגבי מטרות ועד לזיהוי מובילים (leads), ובכך מאפשרת הפחתת סיכונים ביולוגית בשלב מוקדם לפני השקעה משמעותית באופטימיזציה של המובילים.
- ביולוגיה של תגליות: מקל על בדיקת השערות באמצעות בידוד של סוגי תאים עובריים ספציפיים וניטור של סממני דיפרנציאציה.
- סריקה: מספק תאים מופרדים המתאימים לזריעה ידנית וליישום של קריאות מבוססות פלואורסצנציה ואלקטרודות בשלבים הבאים.
- אנליטיקה: מאפשר מדידות כמותיות של פעילות אלקטרופיזיולוגית, זרימת סידן ועוצמת אימונופלואורסצנציה לצורך השוואת תנאים.
- מחקר תרגומי: תומך ברציפות מתרבית תאים עובריים ועד לאימות פרה-קליני על ידי שימור הרלוונטיות להתפתחות העצבית.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס תהליך עבודה להכנת תאים שניתן להרחבה ולשימוש חוזר, הישים על פני פרויקטים מרובים המתמקדים במסלולים נוירונליים או התפתחותיים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי באמצעות שחזור של מורפולוגיה דמוית in vivo וביטוי חלבונים ספציפיים לתא.
- ערך תפעולי: מספק תרביות סטנדרטיות תחת בקרת זיהומים באמצעות שלבי דיסוציאציה וזריעה מוגדרים.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של go/no-go על ידי מתן אפשרות להערכה מוקדמת של מודולציה של מטרה במערכת בהקשר פיזיולוגי.
- השפעה על פורטפוליו: מאפשר תעדוף של מטרות מותאם סיכון בהתבסס על תיקוף פונקציונלי במודל שניתן למניפולציה גנטית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול ב-C. elegans, בדיסוציאציה אנזימטית של רקמות ובטכניקות סטריליות לתרבית תאים.
- תלוי בגישה לכיטינאז, למצע L15 מועשר בסרום, למשטחים מצופים בסובסטרט ולציוד סנטריפוגה.
- מחייב סטנדרטיזציה של תזמון הדיסוציאציה וצפיפות הזריעה כדי להבטיח תנובת תאים וחיוניות עקביות.
- כולל שיקולי התאמה כאשר מרחיבים את השיטה לשלבים עובריים שונים או לזנים מוטנטיים.
- מוגבל בשל הצורך בפיפוט ידני במהלך הדיסוציאציה, דבר העלול להשפיע על התפוקה ללא תמיכה באוטומציה.
