כימות תגובת Burst נשימה כאינדיקטור של החיסון מולדת בריאות בדג הזברה

המטרה הכוללת של הליך זה היא להשתמש בפלואורסצנטיות כדי לכמת את תגובת פרץ הנשימה. ראשית, העמיסו את עוברי דג הזברה לבארות של צלחת 96 בארות. לאחר מכן הוסף מצע פלורסנט והפעל את פרץ הנשימה עם חומר כימי.

לאחר מכן כמת את הקרינה היחסית באמצעות פלואורמטר. בסופו של דבר, הקרינה משמשת להצגת פוטנציאל התפרצות הנשימה. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לחקור כיצד מניפולציות ניסיוניות משפיעות על הבריאות הכללית של מערכת החיסון המולדת.

כאן אנו משתמשים בו כדי לספק תובנה לגבי פרץ הנשימה של עוברי דג הזברה, אך ניתן ליישם אותו גם על מערכות אחרות כגון דג זברה בוגר, תאי כליה ותכשירי תאים ממיני דגים אחרים. לגדל את העוברים בצלחות פטרי עמוקות בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס במי ביצים עד לשלב ההתפתחותי הרצוי. הסר את כל העוברים המתים מדי יום.

שופכים בזהירות את מי הביצים הישנים וממלאים במי ביצים חדשים מדי יום. ביום הניסוי, הכינו תמיסת עבודה מופחתת פלואורסצאין בצינור מיקרו צנטריפוגה עטוף בנייר כסף בנפח 1.7 מיליליטר. הכינו גם תמיסת עבודה של 20 מיקרוגרם למיליליטר PMA ריכוז סופי

לאחר מכן הכינו חמישה מיליליטר מכל תמיסת מינון בצינורות חרוטיים של 15 מיליליטר כמתואר בטקסט הנלווה. שמור את תמיסות המינון על קרח, הפעל תחילה את קורא ה-Microplate וחמם את מקור האור כדי למדוד את הקרינה. הגדר תוכנית המפרטת אורכי גל עירור ופליטה, רגישות מיקום אופטית, וכלול גם שלב טלטול של חמש שניות.

לפני הקנה, סדרו את האספקה הניסיונית של כלים עם עוברים מצופים. מיקרופלייט שחור של 96 באר מקטרת P 200 ומטה דלי קרח עם הפלואורסצאין המכיל ריאגנטים. צינור P 200 רב ערוצי, שני מאגרים סטריליים, נייר אלומיניום ומספריים.

כעת חותכים קצה פיפטה כך שהעוברים או הכליות יוכלו להיכנס דרך הפתח. הגדר מקטרת P 200 ל-100 מיקרוליטר והעביר עובר אחד יחד עם מי ביצים לכמה שיותר בארות של מיקרופלייט שחור של 96 בארות כרצונך. כעת שפכו את תמיסת המינון למאגר סטרילי של 25 מיליליטר עם צינור P 200 רב ערוצי.

הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת מינון H 2D CFDA לעמודה אחת של ה-96. ובכן, מיקרו-צלחת חוזרת על עצמה עבור מחצית מדגימות העובר הבקרה ומחצית מדגימות העובר שעברו מניפולציה בניסוי. יוצקים את תמיסת המינון המכילה PMA למאגר סטרילי חדש של 25 מיליליטר.

לאחר מכן ציטט את תמיסת המינון הזו לעמודות הנותרות של המיקרו-צלחת 96 באר. מכסים את המיקרופלייט בנייר אלומיניום ומניחים על שייקר למשך כ-20 שניות. ב-150 סל"ד, דגרו את ה-Microplate ב-28 מעלות צלזיוס כאשר הוא לא נקרא.

קרא את המיקרו-צלחת לאחר הוספת PMA. המשיכו לבצע מדידות כל כמה דקות למרווח הזמן הרצוי, או דגרו את המיקרו-פלטה העטופה בנייר כסף ב-28 מעלות צלזיוס עד לנקודת זמן קבועה. לאחר מכן, החזרת העוברים מהבארות המתת חסד של העוברים בהתאם לפרוטוקול הטיפול והשימוש בבעלי חיים המוסדיים.

כמו כן, השלך את המיקרופלייט וחומרים חד פעמיים אחרים בצייר הפסולת הביולוגית. החליטו על נקודת הזמן שבה תרצו להשוות פלואורסצנטיות. הפחיתו את ערך הקרינה הממוצע של קבוצת הביקורת הלא מושרה מערכי הקרינה של שפעת קבוצת הביקורת הבודדת המושרה על ידי PMA.

חזור על כך עבור קבוצת הניסוי עם ובלי PMA. לאחר מכן אחסן את ערכי הקרינה המנורמלים הללו בעמודות, קבוצת הבקרה פלוס PMA וקבוצת הניסוי פלוס PMA. לאחר מכן, חשב את הממוצעים וסטיות התקן עבור ערכי הקרינה המנורמלים של קבוצת הבקרה פלוס PMA וקבוצת הניסוי פלוס PMA.

השווה את ערכי הקרינה המנורמלים באמצעות מבחן T לא מזווג כדי לקבוע מובהקות סטטיסטית. כעת, גרף את האמצעים של קבוצת הביקורת פלוס PMA וקבוצת הניסוי פלוס PMA עם פסי שגיאה המשקפים את סטיות התקן המתאימות רושמים את רמת המובהקות בגרף ובמקרא האיור. ניסוי זה משווה את תגובת פרץ הנשימה בעוברי דג זברה מסוג בר מרקע AB לאחר 48 שעות ו-72 שעות לאחר ההפריה.

הקרינה הגולמית נמדדה ארבע שעות לאחר הוספת PMA בקבוצות המושרות PMA. ערכי הקרינה הגולמיים היו גבוהים יותר באוכלוסיית 72 HPF. כפי שמצוין על ידי האמצעים המחושבים, ערכי הקרינה הם המנורמלים כדי לקחת בחשבון את השונות ברמות הקרינה ברקע.

תוצאות בדיקת פרץ נשימה זו חשפו כי 72 עוברי דג הזברה HPF מסוגלים לייצר מיני חמצן תגובתיים משמעותיים יותר ולכן להעלות תגובת פרץ נשימה חזקה יותר מאשר 48 עוברי HPF לאחר זירוז PMA. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש בפלואורסצנציה כדי לכמת את פוטנציאל התפרצות הנשימה של עוברי דג הזברה. אל תשכח שעבודה עם אבקת PMA עלולה להיות מסוכנת ביותר, לכן השתמש באמצעי זהירות כגון חבישת מסכת פנים בזמן שקילת אבקת PMA.