הנובע את מהלך הזמן של חיסול גלוטמט עם ניתוח Deconvolution של זרמי Transporter astrocytic

המטרה הכוללת של הניסוי היא להעריך את מהלך הזמן של פינוי גלוטמט מממברנות אסטרוציטיות לאחר שחרורו מסינפסות מעוררות. השלב הראשון בתהליך זה הוא תיעוד התרחשות הובלת גלוטמט המופעלת סינפטית מאסטרוציטים בפרוסות מוח חריפות בהיעדר ונוכחות של ריכוז רווי תת-קרקעי של אנטגוניסט טרנספורטר גלוטמט רחב ספקטרום, TBOA. השלב השני הוא ניתוח ההקלטות כדי לבודד את זרמי טרנספורטר הגלוטמט המופעלים באופן סינפטי מכל שאר המרכיבים של התגובה המעוררת.

לאחר מכן, מהלך זמן המסנן מוערך על ידי ניתוח זרמי הטרנספורטר שנרשמו בנוכחות TBOA על ידי de מעורבות המסנן מהתרחשות ההובלה שנרשמה בתנאים מבוקרים. מתקבל מהלך הזמן של פינוי גלוטמט מממברנות אסטרוציטיות. התוצאות מראות כי בהיפוקמפוס של העכבר, אסטרוציטים זקוקים לכמה אלפיות שנייה בלבד כדי להסיר גלוטמט המשתחרר באופן סינפטי מבסיס החלל החוץ-תאי.

גישה זו מספקת כלי רגיש לאיתור שינויים ביכולת הספיגה האסטרוציטית באזורי מוח שונים במהלך מצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים. היתרון העיקרי של גישה זו על פני שיטות אחרות המבוססות, למשל, על ניתוח תזוזה של אנטגוניסטים של קולטני גלוטמט המתנתקים במהירות על מדדי גלוטמט פלואורסצנטיים או על סימולציות מחשב של תגובת דיפוזיה, הוא שהיא מספקת רזולוציה זמנית גבוהה, קריאה ניסויית ישירה של פינוי גלוטמט מאסטרוציטים. שיטה זו מאפשרת לנו להבין את הדינמיקה המרחבית והטמפורלית של העברה סינפטית במוח.

זה יכול לעזור לנו לפרש שינויים פתופיזיולוגיים בגלוטמט, דיפוזיה וספיגה שעלולים להתרחש בהפרעות נוירולוגיות מסוימות כגון מחלת אלצהיימר. התחל הליך זה על ידי ביצוע חמישה חתכים במוח עכבר מנותח עם אזמל. ראשית, הסר את נורות הריח ואת קליפת המוח הקדמית.

שנית, הסר את המוח הקטן. לאחר מכן, הסר את האונות הטמפורליות השמאלית והימנית. לאחר מכן הפרד את שתי ההמיספרות במוח עם חתך סגיטלי.

לאחר מכן, הדביקו את המשטח הצדדי של כל חלק במוח ללוחית הבסיס של הוויברם הקר. הצד הגבי של המוח צריך להיות פונה ללהב הוויבראם והצד הגחוני של המוח צריך להיות במגע עם בלוק האגר הרחק מלהב הוויברטו. לאחר מכן אבטח את לוחית הבסיס של הוויברטו לתא הניתוח.

הגדר את עובי הפרוסה ל-250 מיקרומטר והתאם את רוחב הלהב לפני החיתוך. לאחר שהלהב עבר דרך קליפת המוח וההיפוקמפוס, השתמשו באזמל כדי לחתוך את ההיפוקמפוס של קליפת המוח מהמוח האמצעי. לאחר מכן, מניחים פרוסה בתא הטבילה בחום של 34 מעלות צלזיוס לאחר שמירת הפרוסות על 34 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.

הניחו להם להתקרר לטמפרטורת החדר למשך 30 דקות לפני השימוש בהם להקלטות האלקטרופיזיולוגיה בהליך זה, העבירו פרוסה לתא ההקלטה. בדוק חזותית את הפרוסה מתחת לתאורת הנקודות או I-R-D-I-C. ניתן לזהות אסטרוציטים על ידי גוף התא הקטן שלהם והגרעין הבולט שלהם לגירוי סינפטי.

הניחו אלקטרודה דו-קוטבית מנירוסטה במרחק של כ-100 מיקרומטר מהאסטרוציט שאתם מתכננים לתקן. טלאי את האסטרוציט ושבר את כל תצורת התא על ידי הפעלת יניקה עדינה מאוד. לאחר מכן החליפו גירויים בודדים וזוגיים כל 10 עד 20 שניות כדי לבודד את החלקים הקלים של התרחשות הובלה המופעלת סינפטית.

ראשית, ממוצע של לפחות 20 טאטאות שהושגו עם גירויים זוגיים בתנאים מבוקרים, ובנוכחות 10 אנטגוניסטים של טרנספורטר גלוטמט בספקטרום רחב מיקרו-מולרי. לאחר מכן TBOA ממוצע של מספר זהה של סריקות שהושגו עם גירויים בודדים בתנאי בקרה וב-10 מיקרו-מולרי TBOA מפחית את העקבות הממוצעים המתקבלים עם גירויים בודדים מהעקבה הממוצעת המתקבלת עם גירויים זוגיים. שלב זה מאפשר לבודד את ה-STO הגיאומטרי ואת זרם האשלגן המתמשך שמעורר הגירוי השני.

המשמרת הבאה, העקבות הממוצעים המתקבלים עם גירויים בודדים על ידי מרווח זמן התואם את מרווח ה-PUL המשמש להעברת פולסים זוגיים מפחיתים את הזמן שהוסט, התגובה הממוצעת המתקבלת עם גירויים בודדים מהתגובה הממוצעת לגירוי השני שהושג קודם לכן. שלב זה מבודד חלק קל מזרם הטרנספורטר המעורר על ידי הגירוי השני. ברוב המקרים, שלב זה מסיר לחלוטין את זרם האשלגן המתמשך.

אם זה המקרה, הבידוד של ה-FSTC הושלם ואתה יכול להמשיך בניתוח הדה-קונבולוציה ולהגיע למסלול הזמן של פינוי גלוטמט מאסטרוציטים. עם זאת, במקרים מסוימים, זרם אשלגן מתמשך קטן עדיין קיים ונדרש ניתוח נוסף. מדוד את משרעת זרם האשלגן המתמשך שנותר לאחר הביצוע.

הניתוח שתואר קודם לכן קנה מידה של המשרעת של הפונקציה האקספוננציאלית המונו למשרעת זרם האשלגן המתמשך השיורי על ידי הגדרת המשרעת של זרם האשלגן המתמשך הנמדד כמשוואה זו. אך קבוע זמן העלייה מייצג את ערך העלייה הממוצע המוערך בניסויים נפרדים שבהם מבודד זרם אשלגן מתמשך. מבחינה פרמקולוגית, תוך שימוש בריכוז רוויה גבוה של TBOA, הפחיתו את הפונקציה המונו אקספוננציאלית המתקבלת מה-FSTC ומזרם האשלגן המתמשך.

כדי להשלים את הבידוד של ה-FSTC. כדי לבודד את התרחשות ההובלה המופעלת על ידי Flash. בממוצע לפחות 20 טאטאות המתקבלות כאשר נתיב האור פתוח בתנאי בקרה וב-10 מיקרו-מולרי TBOA אז ממוצע אותו מספר של טאטאים המתקבלים כאשר נתיב האור סגור בתנאי בקרה, וב-10 מיקרו-מולרי TBOA מחסיר את העקבות הממוצעים המתקבלים עם נתיב האור שנחסם מהעקבות הממוצעים המתקבלים עם נתיב האור פתוח.

שלב זה מאפשר להסיר את חפץ הגירוי ולבודד את ה-FTCs בשלב זה להתאים את זרם ההובלה FSTC או FTC שנרשם בתנאי בקרה וב-10 מיקרו-מולרי TBOA ולהתאים להם פונקציה מעריכית רב-מעריכית, ליצור פונקציה עולה מיידית הדועכת מונו באופן אקספוננציאלי על פי פונקציה זו והמתארת בצורה הטובה ביותר את שלב הדעיכה של זרם הטרנספורטר שנרשם ב-10 מיקרו-מולרי TBOA. לאחר מכן האציל את הפונקציה האקספוננציאלית המונו מהתאמת זרם הטרנספורטר שנרשם ב-10 מיקרו-מולרי TBOA כדי לגזור את המסנן. לאחר מכן האציל את המסנן מהתאמת זרם הטרנספורטר בתנאים מבוקרים.

כדי לקבל אומדן כמותי של מהלך הזמן הכולל של פינוי גלוטמט, חשב את ה-OID של צורת הגל תוך כדי ניסיון הליך זה. חשוב לוודא שהתרחשות ההובלה נרשמת בתנאי ניסוי שבהם המסנן פועל במשטר ליניארי ומציג רק עיוותים ליניאריים של ההובלה. גל זרם מאלה יכול להיעשות על ידי בדיקת המניפולציות המשנות את גודל זרם ההובלה.

אל תשנה את מסלול החותמת שלו. אחרי הצפייה בסרטון הזה, אתם אמורים להבין היטב כיצד להשתמש בהקלטות אסטרוציטיות כדי לחלץ מידע על גלוטמט, דיפוזיה וספיגה במוח.