אחזור אנטיגן המושרה על ידי חום: שיטה יעילה לאיתור וזיהוי סוגי תאי אב במהלך נוירוגנזה בהיפוקמפוס למבוגרים

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבצע אחזור אנטיגן על רקמת המוח בהיפוקמפוס כדי לדמיין טוב יותר את סוגי תאי האב המולידים נוירונים שזה עתה נולדו. זה מושג על ידי קצירת המוח המעופש מעכבר שחותך חלקים דקים של העטרה, והרכבה של חלקים אלה על מגלשת זכוכית, שתוכננה במיוחד כדי להיצמד חזק לרקמה. השלב השני הוא להרתיח את המגלשות עם טישו וטיפול אטופי של קיי ולאפשר מספיק זמן לקירור.

לאחר מכן, צבעו את הרקמה למשך הלילה בנוגדנים ראשוניים. השלב האחרון הוא לבצע צביעת נוגדנים משנית על הרקמה למחרת למשך שעתיים לפחות. בסופו של דבר, דמיין את סוגי התאים הפרו-מגדריים השונים על פני שלבי ההתפתחות השונים במהלך נוירוגנזה בוגרת של רקמת ההיפוקמפוס עם חלוף זמן או מיקרוסקופיה קונפוקלית.

היי, שמי הון ג'ו, פוסט-דוקטורנט, חבר במעבדה של ד"ר איאן ג'ון ובמאיו קליניק. ההתמקדות העיקרית שלנו במעבדת ג'ון היא חקירת התהליך של נוירוגנזה אחרת בהפרעות נוירולוגיות ופסיכיאטריות. המטרה הסופית שלנו היא לתרגם בהצלחה ידע כזה ליישום טיפולי המדגים את ההליך שלנו של אנטיגן רטריבר יהיה Quam Hui, והיי ג'ון מהמעבדה שלנו.

היתרון העיקרי של הטכניקה שלנו על פני השיטות הקיימות של אימונוהיסטוכימיה הוא שהיא מאפשרת הדמיה יעילה של סוגי תאים שונים במהלך נוירוגנזה של היפוקמפוס בוגר. סוגי תאים אלה, כולל תאי הגזע העצביים הקודמים שאחרת קשה לזהות, ניתנים לתיוג ולהמחשה ביעילות באמצעות השיטה שלנו לאחזור אנטיגן. שיטה זו תספק תובנה לגבי התפתחות וויסות של נוירונים שזה עתה נולדו במהלך נוירוגנזה של היפוקמפוס בוגר.

למעוניינים בחקר הפרעות נפשיות וטיפול תרופתי, אחזור האנטיגן שלנו יוכיח את עצמו כשימושי בחקירת תפקיד ההתפתחות העצבית במהלך מחלה זו. בפתוגנזה. התחל את ההליך על ידי הנחת המוח מעכבר מוטבע ב-4%para פורמלדהיד בצינור חרוטי של 10 מיליליטר למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס, או למשך 12 עד 24 שעות לפחות, אך לא יותר מ-36 שעות לקיבוע מלא. לאחר קיבוע לילה, הסר את PFA והשאיר את המוח בצינור החרוטי.

לאחר מכן, שטפו את המוח עם 30% סוכרוז כדי להסיר שאריות PFA והשליכו את הסוכרוז. לאחר מכן מלאו שוב את השפופרת ב-30% סוכרוז ושמרו אותה על ארבע מעלות צלזיוס עד שהמוח שוקע לתחתית הצינור. לאחר מכן, חתכו את ההיפוקמפוס למקטעי מוח של 40 מיקרומטר על מיקרוטום.

שמור את החלקים בתמיסת הנוזל לרדיאטור עד שהם מוכנים לאימונוהיסטוכימיה. לאחר מכן הרכיבו את הפרוסות על שקופיות המיקרוסקופ שתוכננו במיוחד כדי להיצמד לרקמה חזק. לאחר הרכבת הרקמה, הניחו לשקופיות להתייבש כ -10 דקות.

ניתן לזרז את הייבוש אם השקופיות מונחות על משטח אנכי על מגבת נייר כדי להבטיח הסרה מוחלטת של כימיקלים קודמים. לאחר שהמגלשות יבשות, שטפו אותן עם PB S3 פעמים במשך חמש דקות בכל פעם. ואז תן לזה להתייבש שוב.

בהליך זה, הכינו את התמיסה להרתחת רקמות לפי התיאור בכתב היד המצורף. לאחר מכן, הרתיחו את התמיסה במשך חמש דקות במיקרוגל רגיל בהגדרה סטנדרטית. לאחר השלמת הרתיחה, הוציאו בזהירות את המיכל מהמיקרוגל.

לאחר מכן, העבירו את השקופיות המיובשות לתמיסה. ודא שהצד עם חלקי ההיפוקמפוס חשוף לחלוטין לתמיסה. במידת האפשר, הניחו את המגלשות בזווית כנגד קירות המיכל וערמו סביבן מגלשות אחרות.

לאחר מכן מרתיחים את התערובת עם השקופיות במשך שבע דקות במיקרוגל בהגדרות סטנדרטיות. בינתיים, מלאו שני דליי קרח באמצע הדרך בקרח. לאחר השלמת הרתיחה, הוציאו את המיכל מהמיקרוגל והניחו אותו בתוך אחד מדלי הקרח.

יוצקים את שאר הקרח מהדלי השני מסביב למיכל ומכסים אותו לחלוטין. לאחר מכן, הניחו לו לשבת שעה אחרי שעה. הסר את השקופיות מהמיכל.

שטפו אותם עם מאגר TBST שלוש פעמים במשך חמש דקות בכל פעם. לאחר מכן, יבש את השקופיות בחושך למשך חמש עד 10 דקות או עד שהמגלשה יבשה לחלוטין. בינתיים, הכינו תא עם DDH 2 O לצביעה ראשונית של נוגדנים למשך הלילה.

לאחר שהמגלשות התייבשו, צייר קו מתאר סביב חלקי הרקמה באמצעות עט מעביר מים. מתאר זה משמש כמחסום המונע מתערובת הנוגדנים לזרום. לאחר מכן הכינו את תערובת הנוגדנים העיקרית ב-T-B-S-T-T.

הניחו את השקופיות המיובשות על הבמה בתא הצביעה. הוסף 500 מיקרוליטר של הנוגדן הראשוני לאט כדי לכסות את כל פני השטח. לאחר מכן, כסו את תא הצביעה כדי לחסום את האור החיצוני ושמרו אותו למשך הלילה בטמפרטורת החדר למחרת, שטפו את השקופיות שלוש פעמים במשך חמש דקות בכל פעם עם מאגר TBST.

לאחר מכן, יבש אותם בחושך. כעת הכינו את תערובת הנוגדנים המשנית ב-T-B-S-T-T. לאחר מכן הניחו את השקופיות היבשות בתא הצביעה.

הוסף 500 מיקרוליטר של הנוגדן המשני. כסו לאט את תא הצביעה והרחיקו אותו מאור חיצוני לפחות שעתיים בטמפרטורת החדר לאחר השלמת הצביעה המשנית, שטפו את השקופיות שלוש פעמים במשך חמש דקות בכל פעם עם מאגר TBST, יבשו את השקופיות בחושך לאחר הייבוש. הוסף פתרון הרכבה לשקופיות.

מכסים אותם בזהירות בהחלקות כיסוי על מנת למנוע הכנסת בועות כלשהן. לאחר מכן שמור את השקופיות בחושך לפחות שעתיים לפני הניתוח הבא וביצוע ניתוח זמן-lapse או שיחה על הרקמה המוכתמת. נוירוגנזה של היפוקמפוס בוגר מתוארת על פני האזור התת-גרגירי של הבליטה המשוננת.

גליה רדיאלית מופעלת כמו תא גזע מסוג 1 עוברת דרך שלבים נפרדים כאשר היא מתמיינה, מתבגרת ומשתלבת מבחינה תפקודית עם מורפולוגיה משוכללת לתוך המעגל העצבי. ניתן לזהות כל אחד מהשלבים וסוגי התאים המתאימים על סמך ביטוים של שילוב של סמנים. MCM 2 הוא סמן התפשטות המתבטא בכל סוגי תאי האב המיטוטיים ואילו נין מתבטא בין תאי גזע דמויי גליה רדיאליים ולא רדיאליים.

כאשר האבות מסוג A מבדילים את הביטוי המקונן, הביטוי המקונן נכבה תחילה. אנטי TBR שני ביטוי עולה באב הפוסט-מיטוטי MCM ביטוי שני אובד בעוד ביטוי DCX ו-NEWAN מכתיבים הגירה והתבגרות לנוירון פונקציונלי. זוהי תמונה קונפוקלית מייצגת של MCM סגול, שני נסטון ירוק וכתמים אדומים.

התמונות המוגדלות בתיבות מציגות GL רדיאלי כמו אב אב המבטא neston MCM two ו-dpi. הנה תמונה קונפוקלית מייצגת של MCM כחול שני אדום, TBR שני DCX ירוק ו-dpi אפור. צביעת המאפיין של סוג תאי אב מסוג B מוצגת בתמונות המוגדלות בתיבות המבטאות MCM two, TBR 2D, c, X ו-dpi.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שלושה דברים. האחד, השתמש ברקמה מקובעת היטב בעובי העטרה הנכון. שתיים, הרכבת הרקמה שטוחה על המגלשות ומניעת נזק תוך כדי כך.

ולבסוף, שלוש, המאפשר מספיק זמן לרתיחה ולקירור לאחר מכן במהלך שליפת האנטיגן. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו שחזור רקמות קונפוקליות וניסויי התנהגות על מנת לענות על שאלות נוספות בנוגע לאופן שבו נוירונים שזה עתה נולדו עשויים להשתלב במעגלי ההיפוקמפוס ולתרום לתפקוד הקוגניטיבי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע אנטיגן רטריבר על רקמת ההיפוקמפוס שלך כדי לדמיין ביעילות רבה יותר את סוגי התאים הנוכחיים המולידים נוירונים חדשים במהלך נוירוזה אחרת בהיפוקמפוס.