Centrosomes הדמיה באשכים טוס
20 בספטמבר 2013
הדמיה של חלבוני centrosomal במהלך spermatogenesis דרוזופילה היא שיטה רבת עוצמה לזיהוי חלבונים חדשים חיוניים לביולוגית centrosome, כמו גם על מנת להבהיר את הפונקציה המסוימת של שחקנים ידועים בתהליך זה.
המטרה הכוללת של הליך זה היא להשתמש בסמני סנטרו סומלים מתויגים גנטית כדי לסנן מוטציות גנטיות חדשות ולחשוף את התפקוד של גנים סנטרו סומליים שזוהו לאחרונה. ניתן להשיג זאת על ידי שלוש אסטרטגיות הדמיה שונות. עקוב אחר הדמיה של אשכים חיים, מסלול B, קיבוע כימי של האשכים או עקוב אחר צביעה חיסונית C.
השלב הראשון של ההליך הוא לבודד את האשכים של זבובים המבטאים חלבונים סומליים מרכזיים מתויגים גנטית, שאחריהם ניתן לבצע הדמיה מיידית. השלב השני הוא קיבוע כימי של האשכים, שאחריו ניתן גם להדמיה. שלישית, האשכים יכולים להיות מוכתמים במערכת החיסון ולאחר מכן לדמות.
בסופו של דבר, מיקומם של חלבונים צנטריים מזוהים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האזור המרכזי, כגון בסיס מולקולרי של היווצרות מרכזית, התארכות מרכזית והפרדה מרכזית. התחל בבידוד אשכי דרוזופילה כמפורט בפרסום JoVE 2 6 4 1.
לאחר בידוד האשכים, טבלו את הדגימה בשישה מיקרוליטרים של מאגר מכתים טרי בטמפרטורת החדר על שקופית מיקרוסקופ זכוכית טעונה חיובית. המתן 10 דקות, ולאחר מכן שטוף בעדינות את עודפי ה-DPI על ידי החלפת מאגר הצביעה פעמיים. עם שישה מיקרוליטר PBS.
היזהר לא לשטוף את האשכים. הסר את התמיסות מהשקף באמצעות פיסת נייר סינון כדי לנדף אותה. שישה נפחי מיקרוליטר עובדים היטב עבור החלקות כיסוי של 18 מילימטר רבוע.
כעת זה עוזר להשתמש באזמל חד כדי לנקב את האשכים ליד סוג התא המעניין, וזה ממזער את הלחץ על תאים אלה במהלך שלב הריסוק. לאחר מכן הניחו בזהירות תלוש כיסוי על גבי הדגימה ואטמו אותה עם לק. לאחר מכן סמן את מיקום האשכים על השקופית בעזרת עט והמשך להדמיה.
לאחר בידוד האשכים, טבלו אותם בטיפה של שישה מיקרוליטר של PBS על גבי שקופית מיקרוסקופ זכוכית טעונה חיובית. כיוון ידני את האשכים בצורה ליניארית או לפי העדפה אחרת. לאחר מכן השתמש בפיסת נייר סינון כדי לנדף את ה-PBS ולהחליף אותו בשישה מיקרוליטרים של מאגר קבוע טרי שהוכן מראש.
לאחר חמש דקות במאגר הקבוע, נדפו אותו בעזרת פיסת נייר פילטר. כעת טבלו את הדגימה בשישה מיקרוליטרים של מאגר צביעה DPI טרי שהוכן למשך 10 דקות. שטפו את ה-DPI על ידי החלפתו בשני נפחים של שישה מיקרוליטר של PBS.
לאחר מכן הניחו בזהירות כיסוי בגודל 18 מילימטר מרובע על גבי הדגימה ואטמו אותה עם לק. לאחר מכן סמן את מיקום האשכים בשקופית והמשך בהדמיה. עבור הליך זה תחילה, הכינו כמה פתקי כיסוי סיליקון.
ראשית, טבלו את החלקות הכיסוי במגש קטן של תמיסה סיליקונית למשך דקה בטמפרטורת החדר מתחת למכסה אדים, וודאו שהחלקות הכיסוי חשופות לחלוטין ואינן נערמות זו על גבי זו. לאחר מכן, שטפו את הכיסוי שלוש פעמים במים למשך דקה אחת לכל כביסה. לאחר מכן יש שלוש שטיפות של דקה אחת באתנול 70% ושטיפה אחרונה של דקה במים.
לאחר מכן אפשר להחלקות הכיסוי הסיליקון להתייבש באוויר מתחת למכסה אדים. לאחר ניתוח מספר אשכים וקבר שקופית עם סוג הדגימה, הוסף חמישה מיקרוליטר של PBS לכיסוי הסיליקון והעביר את האשכים לטיפה של PBS. יש צורך במספר פתקי כיסוי שלכל אחד מהם אשך בודד כדי להבטיח הצלחה.
לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ דיסקציה, חודרים בזהירות כל אחד מהאשכים כפי שהודגם קודם לכן. כעת, הניחו בעדינות מיקרוסקופ זכוכית טעון חיובית. החלק מעל החלקת הכיסוי, ואפשר ל-PBS להתפזר באופן שווה בין החלקת הכיסוי למגלשה.
לאחר מכן נדפו את המאגר העודף בין החלקת הכיסוי להחלקה, מה שיגביר את הלחץ על האשכים וימעך אותם. כעת זרוק את השקופית המוכנה לחנקן נוזלי. כעת ניתן להכין מגלשות נוספות ולהוסיף למיכל.
לפני שתמשיך להשתמש במלקחיים גדולים, הסר את אחת השקופיות מהחנקן הנוזלי והשתמש במהירות באזמל כדי להסיר את החלקת הכיסוי. הדגימה צריכה להישאר על השקופית תוך הסרת החלקת הכיסוי מהדגימה. היזהר לא למרוח אותו על פני שקופית ה-S.
ניתן להשיג זאת על ידי שימוש באזמל כדי להחליק את הכיסוי בתנועה מהירה אחת. כעת דגרו את השקופיות בצנצנת זכוכית מזכוכית מלאה במתנול. צונן במינוס 20 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
לאחר הדגירה מעבירים את השקופיות לצנצנת המכילה אצטון. צונן במינוס 20 מעלות צלזיוס לאחר 30 שניות באצטון. שוטפים את השקופיות למשך דקה ב- PBS בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן, דגרו את המגלשות למשך 10 דקות ב-PBST טרי שהוכן כדי לחסום אתרים לא ספציפיים במהלך הדגירה של PBS TB, מלאו את הבארות של תא לחות במים לאחר 10 דקות, הסר את המגלשות מה-PBST וייבש כל מגלשה סביב הדגימה. היזהר לא לייבש את הדגימה עצמה. כאשר כל מגלשה מיובשת.
הניחו אותו בתא הלחות. חשוב לייבש את אזור המגלשה המקיפה את הדגימה לפני הוספת תמיסת הנוגדנים. זה מבטיח שהנוגדן יישאר ממוקם על הדגימה, ובכך מונע ייבוש במהלך שלב הדגירה.
לאחר מכן זרוק בעדינות 100 מיקרוליטר של נוגדן ראשוני מדולל ב-P-B-S-T-B-R שהוכנו לאחרונה על הדגימות. השתמש בדילול של 1 עד 200 עבור נוגדנים לא אופייניים. לאחר מכן הניחו חתיכה מרובעת של פרפורם בסנטימטר אחד על גבי הדגימה כדי לפזר את תמיסת הנוגדנים ולהגן על תמיסת הנוגדנים מפני אידוי.
אפשר לדגימות לדגור במשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר שעה, השתמש במלקחיים כדי להסיר בעדינות את הפרפורם מהשקופיות. לאחר מכן שטפו את השקופיות שלוש פעמים ב-PBST בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות לכל כביסה.
לאחר מכן, העבירו את השקופיות לתא הלחות כשהדגימה פונה כלפי מעלה הוסיפו בעדינות 100 מיקרוליטר של נוגדן משני מדולל ב-PBST, BR על הדגימות. כמו קודם, יש למרוח פרפורם ולהמתין שעה לשטוף את המשני עם שלוש שטיפות של חמש דקות ב-PBST ולאחר מכן שלוש שטיפות של חמש דקות ב-PBS. לאחר מכן מחק בזהירות את השקופיות יבשות מבלי לגעת בדגימות.
הוסף שישה מיקרוליטר של מדיית הרכבה והחל החלקת כיסוי סטנדרטית. לאחר איטום החלקת הכיסוי עם לק וסימון מיקום האשכים, המשך בהדמיה. צנטרוזומים עוברים טרנספורמציות מורפולוגיות ותפקודיות מרובות במהלך הזרע.
תהליך אחד שנצפה בקלות הוא התארכות צנטרוזום בזרעונים, סמן ה-LAR ANA GFP אחד מסמן את ה-ole באורך 0.6 מיקרון ש-ole זה מאריך במהלך הזרע ומגיע לאורך של 2.5 מיקרון בזרעונים כמעט בוגרים. מכיוון ששמני צנטרי של זרע דרוזופילה הם ארוכים במיוחד, ניתן להשתמש בהדמיה כדי להצהיר הצהרות כמותיות לגבי התארכות צנטרוזום. בהשוואה למורפולוגיה של סוג הבר, זוהו מוטציות שונות המשנות את הצמיחה המרכזית.
שתי דוגמאות הן תמיד מוטציות מוקדמות וכדורי תותח שעוצרות את הזרע לפני הופעת המיוזה, אך אינן חוסמות את התארכות הסנט במוטציות אלה שמנים של הזרעונים הבוגרים גדלים לכ-2.4 מיקרון בהשוואה לשמני סנט של תאי ביקורת, המגיעים לאורך מקסימלי של 1.8 מיקרון. לאחר שליטה ניתן לבצע את רצועה A תוך 20 דקות, רצועה B תוך 30 דקות ומסלול C תוך שלוש עד חמש שעות בהתאם לגודל המדגם. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לדמיין צנטרוזום בטיסה.
סקירה כללית
מאמר זה מפרט טכניקות דימוי של חלבונים צנטרוסומליים במהלך ספרמטוגנזה ב-Drosophila, במטרה לזהות חלבונים קריטיים ואת תפקודיהם בביולוגיה של הצנטרוסום.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- גנטיקה
רקע
- צנטרוזומים ממלאים תפקיד מכריע בחלוקת התאים ובארגונם.
- Drosophila משמשת כאורגניזם מודל יעיל לחקר הביולוגיה של הסנטרוזום.
- טכניקות דימות יכולות לחשוף את הדינמיקה של חלבונים בצנטרוסומליים.
- הבנת תהליכים אלו יכולה לספק תובנות לגבי מנגנונים ביולוגיים רחבים יותר.
מטרת המחקר
- שימוש בסמני סנטרוזום מתויגים גנטית לסריקת מוטציות גנטיות חדשות.
- חשיפת התפקידים של גנים סנטרוזומליים שזוהו לאחרונה.
- בחינת הבסיס המולקולרי של היווצרות הסנטרוזום ותפקודו.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בידוד אשכים של Drosophila המבטאים חלבונים סנטרוסומליים מתויגים.
- שלוש אסטרטגיות דימוי: דימוי חי, קיבוע כימי וצביעה אימונופלוורסצנטית.
- מיקרוסקופיה פלוורסצנטית לזיהוי מיקומם של חלבונים סנטרוסומליים.
- שימוש בבופרים ובנוגדנים ספציפיים להשגת דימוי יעיל.
תוצאות עיקריות
- דימוג מוצלח של חלבוני סנטרוזום בתנאים שונים.
- זיהוי של חלבוני סנטרוזום חדשים ותפקודיהם.
- תובנות לגבי הדינמיקה של התנהגות הסנטרוזום במהלך הספרומטוגנזה.
- השלכות פוטנציאליות להבנת מחלות הקשורות לסנטרוזום.
מסקנות
- טכניקות ההדמיה מספקות מסגרת חסונה לחקר הביולוגיה של הצנטרוזום.
- הממצאים תורמים להבנת תפקיד הצנטרוזום בחלוקת התא.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על שיטות אלו כדי לבחון תהליכים תאיים אחרים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית לדרג הניהולי
דימוי של סנטרוזומים באשכים של Drosophila מאפשר ניתוח ברזולוציה גבוהה של דינמיקה של חלבונים סנטרוזומליים, ובכך תומך בתיקוף מטרות בשלבים מוקדמים במסלולי חלוקה ודיפרנציאציה של תאים. גישה זו מספקת ביטחון חיזוי בזיהוי ואפיון של חלבונים חדשים המעורבים בתפקוד הסנטרוזום, ומספקת מידע ישיר להחלטות תיק בביולוגיה של גילוי (discovery biology). יכולת ההרחבה והנגישות הגנטית של השיטה ממצבות אותה כפלטפורמה רב-פעמית להפחתת סיכונים מכניסטיים במגוון תוכניות מו"פ.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של תפקוד חלבוני סנטרוזומי ומעורבות של מסלולים במהלך הספירמטוגנזה.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי הבחנה בין השפעות של מוטציות גנטיות ספציפיות על מורפולוגיה ודינמיקה של הסנטרוזום.
- מקל על תיקוף תפקודי של מטרות באמצעות דימוי כמותי של התארכות והפרדה של הסנטרוזום.
- מספק מערכת חסונה למיון גנים מועמדים על בסיס השפעה פנוטיפית.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מכין מודלים מאושרים של Drosophila המבטאים חלבונים צנטרוזומליים מתויגים לצורך סריקות גנטיות המשך.
- מנstandardize את תהליכי ההדמיה תוך שימוש בדגימות חיות, מקובעות ובדגימות שעברו צביעה אימונוהיסטוכימית לקבלת תוצאות כמותיות הדירות.
- מאפשר סריקה רחבה של מוטנטים לזיהוי רגולטורים חדשים של הביולוגיה של הצנטרוזום.
- מספק קריאות פנוטיפיות מהימנות להערכת השפעת תרכובות או הפרעות גנטיות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם מנגנונים רלוונטיים למחלות שבהם תפקוד לקוי של הסנטרוזום תורם לפתולוגיה.
- תומך ברציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני, על ידי מתן אפשרות למחקרים מכניסטיים במערכת ניתנת לשליטה גנטית.
- מספק הפחתת סיכונים חזויה (predictive de-risking) עבור קידום יעדים המעורבים בהפרעות בחלוקת תאים ובדיפרנציאציה.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
פלטפורמת דימות זו משלבת שלבים החל מהגילוי המוקדם ועד לזיהוי מובילים (lead identification), ותומכת בבדיקת השערות ובבירור מכניסטי בביולוגיה של הסנטרוזום.
- ביולוגיה של הגילוי: דימוי כמותי של מורפולוגיית הצנטרוסום מאפשר חקירה מונחית-השערות של תפקוד חלבונים ומיפוי מסלולים.
- סריקה: פרוטוקולי דימוי סטנדרטיים מבטיחים הדירות ומוכנות של הבדיקה לניתוח מוטנטים בסביבה של סריקה רב-מדגם (high-throughput).
- אנליטיקה: מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מספקת מדידות כמותיות של התארכות והפרדה של הצנטרוסומים לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: תובנות מכניסטיות תומכות במודלים פרה-קליניים של מחלות הקשורות לחלוקת תאים כאשר הן מגובות בראיות גנטיות.
- שימוש חוזר ארגוני: מערכת האשחכים של ה-Drosophila משמשת כפלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר עבור תיקוף מטרות שוטף ומחקרי גנומיקה תפקודית.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות הקשורות לסנטרוזום.
- ערך תפעולי: מספק זרימות עבודה של דימיון (imaging) סטנדרטיות, ניתנות להרחבה ו可שחזרות עבור סריקה גנטית ופנוטיפית.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת של המשך או הפסקה (go/no-go) ותיעדוף יעיל של משאבים עבור מטרות בשלב הגילוי.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בקידום מותאם סיכונים ובמיון של גנים מועמדים המעורבים בחלוקת תאים ובידול.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בגנטיקה של Drosophila ובמיקרוסקופיה פלואורסצנטית מתקדמת.
- נדרשת גישה לתשתיות דימות ולסמנים מתויגים גנטית שעברו תיקוף.
- נדרשת סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי הכנת הדגימות והדימות.
- התאמה למערכות מודל אחרות עשויה לדרוש אופטימיזציה של כלים גנטיים וסמנים.
- התפוקה והיכולת להרחבה (scalability) מושפעות מטיפול בדגימות ומקיבולת הדימות.
