בידוד של קליפת המוח Microglia עם immunophenotype משומר ופונקציונאלי מילודי Murine
30 בינואר 2014
מפתח אחד לחקירה מוצלחת של הביולוגיה microglial הוא שימור immunofunction microglial vivo לשעבר במנותק מרקמת מערכת העצבים המרכזית. בידוד מיקרוגליה דרך תוצאות רועדות סיבוביות בתרביות תאים טהורות וimmunofunctional מאוד כפי שהוערך על ידי הדמיה ניאון, immunocytochemistry, והפעלת מיקרוגליה הבאות ELISA עם lipopolysaccharide מעודדי דלקת הגירויים (LPS) ופאם 3 צסק"א 4 (פאם).
המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד מיקרוגליה קליפת המוח מיילודים עכברים. זה מושג על ידי מיקרוסים ראשונים המנתחים רקמת מוח קליפת המוח מיילודים מורנים. השלב השני הוא גידול תרביות תאי גליה מעורבות במשך 17 עד 21 יום במבחנה.
לאחר מכן, המיקרוגליה מבודדת מתרביות גליה מעורבות אלה. השלב האחרון הוא צלחת תאי מיקרוגליה בצלחות תרבית תאים לניסויים נוספים. בסופו של דבר, נעשה שימוש במיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית ו-Eliza כדי להראות שפרוטוקול בידוד זה משמר את הפנוטיפ החיסוני והפונקציונליות של מיקרוגליה.
הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שה-SEP המעורב במיקרו-דיסקציה קשה לביצוע. ביצוע מוצלח של הליך זה דורש מהירות ודיוק כאחד. זה איטי מדי יפחית את תפוקת התאים שלך בעוד שהסרה לא מלאה של קרומי המוח תזהם את תרבית הגליה ותעכב את צמיחת הגליה.
התחל בהכנת המדיה השלמה של microglia המכונה להלן MCM. הכינו בקבוק אחד לכל גור ודגרו עליו למשך שעה לפחות. שלב שיווי משקל זה חיוני להצלחה.
לאחר מכן, מכינים אליקוט ומצננים על קרח. כל המדיה הנדרשת היא שישה מיליליטר MCM לכל גור ולחמם באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס לפני הדיסקציה. נגב את תחנת העבודה האופקית של זרימת האוויר ומיקרוסקופ החיתוך עם 70% אתנול.
לאחר מכן הנח את כלי הניתוח המעוקרים הדרושים להליך לאזור העבודה. הכינו צלחת סטרילית עם אמצעי חיתוך ללכידת הראש ואחרת לדיסקציה. הוציא את חומר הטחינה לצלחת משלו לטחינת רקמת המוח.
לאחר עריפת הראש וחילוץ המוח, הניחו את המוח המבודד הטרי מתחת למיקרוסקופ מנתח כדי לדמיין את הנימוסים, והקפידו לשמור על הצד הגבי כלפי מעלה ויבש. אבטח את המוח על ידי החדרת קצות המלקחיים לתוך הצומת של המוח התיכון וקליפת המוח. לאחר שנמצא במקום, הסר לחלוטין את קרומי המוח בקליפת המוח הגבית.
לאחר מכן, הסר את קרומי המוח הגחוניים כדי למקסם את טוהר התפוקה והתפוקה של מיקרוגליה. חיוני להסיר לחלוטין את כל רקמת קרום המוח. הפרד את קליפת המוח משאר המוח.
הקפד להסיר את כל שאריות קרומי המוח בקליפת המוח שעלולות להיות בצד הגחון או המדיאלי של קליפת המוח. לאחר הסרת רקמת קרום המוח, הניחו את קליפות המוח בצלחת הטחינה שהוכנה קודם לכן. עובדים בארון בטיחות ביולוגי מדרגה שנייה, השתמשו במספריים כדי לטחון את רקמת המוח.
העבירו את הרקמה הטחונה לצינור חרוטי בגודל 15 מילימטר. שטפו גם את המספריים וגם את צלחת הטחינה עם מיליליטר אחד של אמצעי טחינה כל אחד כדי למקסם את התשואות. אסוף והוציאו את השטיפות הללו לתוך הצינור החרוטי של 15 מיליליטר המכיל את הרקמה הטחונה.
השאירו את תרחיף הרקמות ללא הפרעה למשך דקה עד שתיים, ואפשרו לרקמה הטחונה להתיישב בתחתית הצינור. לאחר זמן זה, הסר בזהירות והשליך שני מיליליטר של הסופרנטנט, הקפד לא לשבש את הרקמה הטחונה המיושבת. הוסף שלושה מיליליטר של ה- MCM שחומם בעבר לרקמה הטחונה, ולאחר מכן טרף את הרקמה בכוח.
לא אמורה להישאר רקמה מוצקה שניתן להבחין בה כאשר הטרייר הושלם. הוסף עוד שלושה מיליליטר של MCM באמצעות אותו קצה פיפטה כדי לאסוף שאריות דגימה משולשת מהקצה. לאחר האיסוף, צנטריפוגה את הרקמה הטחונה כדי לגלול את התאים.
בסיום החזר את התאים הגלולים לארון הבטיחות הביולוגי. הסר בזהירות והשליך את הסופרנטנט. החייאה בעדינות.
השעו את גלולת התא בשני מיליליטר MCM חם, ואז הוסיפו את תרחיף החייאת התא לבקבוק שהוכן קודם לכן. דגרו על התאים למשך 24 שעות. לאחר 24 שעות, יש לטפוח בעדינות על כף היד כדי לשבש את שאריות הרקמות.
בדוק את התאים לפני ואחרי ההקשה כדי לוודא שהפסולת מוסרת לחלוטין. לאחר מכן, החלף את המדיה ב- MCM טרי והחזיר את הבקבוק לחממה. בדוק את התאים מדי יום כדי לעקוב אחר צמיחה וזיהום.
לאחר כ-17 עד 21 יום, תאי מיקרוגליה יהיו מוכנים לקציר כדי לקבוע אם התאים מוכנים, לבחון אותם תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה הפוכה. מיקרוגליה מוכנה לקציר. כאשר הם הגיעו לשטף של כ-40%, הם נראים כתאים כדוריים קטנים ובהירים הגדלים כחד-שכבה על גבי אחרים.
כדי לבודד, מיקרוגליה מקישה במרץ את הבקבוק על ספסל המעבדה. תסיסה זו עוזרת להפריד מיקרוגליה מתאי גליה אחרים בשל תכונות ההיצמדות הנמוכות של מיקרוגליה. אטמו את מכסי הבקבוק עם פרפורם וסובבו את תרביות הגליה המעורבות באמצעות שייקר סיבובי לא לח מבוקר טמפרטורה למשך חמש שעות.
לאחר זמן זה, בדוק ויזואלית שהמיקרוגליה התרוממה ממשטח הבקבוק. באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה הפוך, מיקרוגליה הם תאים כדוריים בהירים צפים חופשיים. תהיה שכבה שיורית של אסטרוציטים ואוליגודנדרוציטים הנצמדים לתחתית הבקבוק
.לאחר מכן, אספו את הסופרנטנט המכיל את המיקרוגליה לתוך צינור צנטריפוגה חרוטי סטרילי וחך. החייאה. השעו את גלולת המיקרוגליה במדיום גידול מיקרוגליאלי חם וקבעו את ריכוז התאים באמצעות צלחת ציטומטר המו. התאים בפורמט צלחת 24 בארות על כיסוי פלסטיק או זכוכית סטרילית מחליקים 24 שעות לאחר מכן.
החלף את המדיה ב-MGM חם וטרי כדי להסיר תאים צפים ופסולת. שלב זה הוא קריטי להישרדות התאים וכדי לשמור על מיקרוגליה רגועה, תאי מיקרוגליה מוכנים לניסויים מיד לאחר שלב ההזנה מחדש כדי להעריך את טוהר המיקרוגליה. תרביות תאים שמקורן במיקרוגליה המבטא GFP באופן אנדוגני נצבעו עבור אנטיגן המקרופאגים IBA אחד ונצבעו נגדית ב-dapi.
על מנת לדמיין את גרעין התא, יותר מ-95% מהתאים הראו קו-לוקליזציה של GFP IBA one ו-dpi. לאחר שאתגר את התאים עם LPS, המיקרוגליה אימצה שינוי מורפולוגי חד מפנוטיפ דו-קטן לצורה דמוית אמבואיד. צביעה אימונו-פיטוכימית עבור P 65 מעידה כי בתנאים רגילים P 65 ממוקם באופן מפוזר בכל הציטופלזמה.
בעוד שלאחר חשיפה של שעתיים ל-Pam P 65, התגובה החיסונית שינתה באופן דרמטי את הלוקליזציה לגרעין התא כדי לאשר שמיקרוגליה מבודדת שמרה על הפונקציונליות החיסונית הביוכימית שלה. הפרשת הציטוקין הפרו-דלקתי TNF אלפא נקבעה לאחר חשיפה ל-PAM או LPS. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד מיקרוגליה קליפת המוח משיקוף יילודים לקבלת התוצאות הטובות ביותר.
חשוב לשמור על טכניקה סטרילית ולהסיר ביסודיות רקמת קרום המוח מאזור קליפת המוח המנותחת.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר פרוצדורה לבידוד מיקרוגליה קורטיקלית מחתרי新生 (neonates) של עכברים, תוך דגש על חשיבות השמירה על התפקוד האימונולוגי של המיקרוגליה במהלך התהליך. שיטת הבידוד כוללת דיסקציה מיקרוסקופית של רקמת מוח, תרבית של תאי גליה מעורבים, ובידוד עוקב של מיקרוגליה לצורך ניסויים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- אימונולוגיה
רקע
- מיקרוגליה ממלאת תפקיד מכריע במערכת העצבים המרכזית (CNS).
- שיטות בידוד עשויות להשפיע על התפקוד של תאי מיקרוגליה.
- שימור התפקוד החסוני חיוני להשגת תוצאות ניסוייות מדויקות.
- גירויים פרו-דלקתיים משמשים להערכת השפעתו של שפעול המיקרוגליה.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול מהימן לבידוד מיקרוגליה מ新生-עכברים (neonates).
- הבטחה שהמיקרוגליה המבודדת תשמור על הפנוטיפ החיסוני ותפקודיותה.
- סיוע לביצוע ניסויים נוספים בביולוגיה של המיקרוגליה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- מיקרו-דיסקציה של רקמת מוח קורטיקלית מעכברים רכים.
- תרבית של תאי גליה מעורבים למשך 17 עד 21 ימים in vitro.
- בידוד של מיקרוגליה מתרביות גליה מעורבות.
- שימוש במיקרוסקופיית אימונופלואורסנציה וב-ELISA להערכת התפקוד של המיקרוגליה.
תוצאות עיקריות
- פרוטוקול הבידוד מניב תרביות מיקרוגליה בדרגת טוהר גבוהה.
- מיקרוגליה שומרות על מאפיינים תפקודיים-חיסוניים לאחר הבידוד.
- הפעלה באמצעות LPS ו-Pam 3 CSK 4 מדגימה תפקוד שנשמר.
- דימות פלואורסצנטי ואימונוציטוכימיה מאשרים את התוצאות.
מסקנות
- שיטת הבידוד המתוארת יעילה להשגת מיקרוגליה תפקודית.
- שימור התפקוד האימונולוגי הוא קריטי לחקר הביולוגיה של המיקרוגליה.
- ניתן להחיל פרוטוקול זה על מערכי ניסוי שונים הכוללים מיקרוגליה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך סיכום
בידוד של מיקרוגליה תפקודית מחתוליות של עכברים מאפשר הפחתת סיכונים מנגנונית בתיקוף מטרות בנוירו-אימונולוגיה, על ידי שימור האימונופנוטיפ והתגובה לגירויים דלקתיים. מודל ex vivo זה תומך בביטחון ניבוי בשלבים מוקדמים של הגילוי על ידי שמירה על מצבים רגועים (quiescent) ומפועלים הרלוונטיים למסלולי מחלות של ה-CNS. השיטה מספקת מערכת רלוונטית למחלה לסריקת תרכובות אימונו-מודולטוריות ולהערכת מעורבות המטרה (target engagement) בזרימות עבודה פרה-קליניות.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של מסלולי הפעלה של מיקרוגליה באמצעות מבחני אתגר עם LPS ו-Pam3CSK4.
- ערך תפעולי: מניב מיקרוגליה קורטיקלית בדרגת טוהר גבוהה, תוך שימור התפקוד של מעבר גרעיני של NF-κB p65 והפרשת TNF-α.
- ערך ניבוי: תומך בבדיקת היפותזות לגבי מטרות על ידי שמירה על נאמנות אימונופנוטיפית ממצבים שקטים למצבים פרו-דלקתיים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מספק מערכת סטנדרטית של שכבה אחת של מיקרוגליה לסריקת תרכובות לאחר 17–21 ימים של הבשלה של תרבית גליאלית.
- ערך תפעולי: מאפשר כימות של טוהר המיקרוגליה באמצעות קולוקליזציה של IBA-1/GFP (מעל 95%) ומדדים תפקודיים כגון שחרור ציטוקינים.
- מוכנות הבדיקה: מיקרוגליה מבודדת מראה תגובות מורפולוגיות ותפקודיות לגירויים, מה שמאפשר בניית פרופיל תגובה-מנה אמין.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך תרגומי: שומר על התפקוד המיקרוגליאלי ex vivo, ובכך תומך ברציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני של יעדי דלקת נוירולוגית.
- הפחתת סיכונים מכניסטיים: משמר תפקוד ביוכימי (סיגנלינג של NF-κB, שחרור TNF-α) הקריטי להערכת מודולציה של מסלולים המתווכים על ידי היעד.
- רלוונטיות למחלה: מדמה מצבים של מיקרוגליה שקטה ופעילה, הישמימים למחקר של מחלות נוירודגנרטיביות ודלקתיות נוירולוגיות.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
שיטת הבידוד משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד לזיהוי מובילים (leads), על ידי אספקת פלטפורמת מיקרוגליה הניתנת לשחזור למחקרים של מנגנוני פעולה ולסריקה פנוטיפית בתחום הנוירו-אימונולוגיה.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בהבהרת מסלולים באמצעות בדיקות של translocation של NF-κB והפרשת ציטוקינים לאחר גירוי חיסוני.
- סריקה: מאפשר סטנדרטיזציה של הבדיקה באמצעות תנובה עקבית של מיקרוגליה, טהרות ותגובתיות תפקודית לאחר בידוד באמצעות שייקר סיבובי.
- אנליטיקה: מייצר משתנים תלויים כמותיים, כולל רמות הפרשת TNF-α ולוקליזציה גרעינית של p65, לצורך ניתוח השוואתי של תנאים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין תפקוד מיקרוגליאלי ex vivo לרלוונטיות in vivo באמצעות שימור האימונופנוטיפ וקינטיקת ההפעלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס זרימת עבודה הניתנת לשימוש חוזר לבידוד מיקרוגליה, הישימה במספר קמפיינים של תיקוף מטרות ב-CNS.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזויי בתיקוף המטרה באמצעות שימור האימונופנוטיפ של המיקרוגליה ופונקציונליות המגיבה לגירויים.
- ערך תפעולי: בידוד סטנדרטי באמצעות ערבול מכני מניב תרביות מיקרוגליה ניתנות לשחזור עם טוהר של >95% ושלמות פונקציונלית.
- ערך אסטרטגי: מפחית עמימות מכניסטית בסריקת נוירו-אימונולוגיה על ידי שמירה על התנהגות מיקרוגליה ex vivo המעידה על מצבים in vivo.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעוד ותיעדוף של מטרות אימונו-מודולטוריות מותאם סיכון, על בסיס מעורבות מטרה מתוקפת במבחני מיקרוגליה פונקציונליים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בדיסקציה של רקמות עכברים ניאונטליים ובטכניקות סטריליות לתרביות גליאליות.
- תלוי במכשיר ניעור סיבובי עם בקרת טמפרטורה ובמיקרוסקופ פאזה הפוך לצורך בידוד ואימות של מיקרוגליה.
- מחייב סטנדרטיזציה של הסרת הקרומים (meninges) ושל משך התרבית (17–21 ימים) בין הצוותים כדי להבטיח את תנובת המיקרוגליה ואת טהרתה.
- התאמה למערכות מודל אחרות עשויה לדרוש אופטימיזציה של תזמון הדיסוציאציה ותכונות ההיצמדות של המיקרוגליה.
- מגבלה מעשית: תנובת המיקרוגליה תלויה בהסרה מלאה של רקמת הקרומים כדי למנוע זיהום של התרבית הגליאלית.
