הקרנת גנטיקה קדימה VIGS בתיווך לזיהוי גני המעורבים בהתנגדות Nonhost

המטרה הכוללת כאן היא להדגים את המתודולוגיה המשתמשת בהשתקת גנים המושרה על ידי וירוסים לזיהוי גנים המעורבים בעמידות לא-מארחת להשגת VIGs של הצמח האנדוגני. גן המטרה לחסן צמחי ניקוטיאנה חמאמה עם וירוס רעשן טבק תאנים בונות הנושאות שבר של גן המטרה, מכינים ומחסנים את תרביות הפתוגנים הלא-מארחים המבטאות חלבון פלואורסצנטי ירוק על עלי הצמח המושתק של הגן. לאחר מכן, העריכו את המושבות הפלואורסצנטיות הירוקות של פתוגן שאינו מארח תחת אור UV בחושך.

על מנת לזהות צמחים מושתקים גנטיים הפוגעים בעמידות שאינם מארחים, זהו את גן המטרה על ידי ריצוף התוספת בווקטור הנגיף. בסך הכל, מתודולוגיה זו של סריקה גנטית קדימה בתיווך VIX מאפשרת לחוקרים לזהות בקלות גנים המעורבים בעמידות של צמחים שאינם מארחים נגד פתוגנים חיידקיים. תוך פרק זמן קצר, הבנו שהחשיבות של שילוב השתקת גנים המושרה על ידי וירוס תיווך גנטיקה קדימה עם פתוגנים המבטאים GFP UV כדי לזהות את הגנים האחראים שאינם עמידים ל-ST.

כאשר עשינו בעבר סקר גנטי קדימה מייגע על ידי ניקוד עבור תגובת יתר מוות תאים המושרה ומוות תאים המושרה על ידי מחלה. אז זרעי ניקוטיאנה בן על תערובת עציצים ללא אדמה מנביטים את הזרעים בתא גידול. לאחר שלושה שבועות, השתלו את השתילים בעציצים בודדים, גדלו אותם בחממה לפחות יומיים-שלושה לפני נגיף רעשן הטבק.

חיסון וקטור תאנים מפשיר בהדרגה את הגבעולים הקפואים של אגרובקטריום המכילים את שיבוטי ה-cDNA. Intv שני וקטור בתנאים סטריליים מחסנים את תרביות האגרובקטריום הבודדות על לוריא. צלחות אגרו של ברטי דוגרות על הצלחות בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס עד יומיים.

גדל ארבע מושבות שכפול עבור כל שיבוט כך שיהיה מספיק חיסון אגרובקטריום זמין לחיסון של שני צמחים. חסנו את TRV אחד למדיום נוזלי Luria barti. קצרו את התרביות שגדלו במהלך הלילה על ידי צנטריפוגה, השעו מחדש את החיידקים בחיסון, חוצצים ודגרו במשך שלוש שעות בטמפרטורת החדר על שייקר ב-50 סל"ד.

לאחר קצירת התאים על ידי צנטריפוגה, יש למדוד צפיפות אופטית ולהחיות את כדורי החיידקים במאגר MES של חמישה מילי-מולרי pH 5.5 לאחר מכן יש לחסן את תרבית חיידקי T RV אחת בעלת OD 600 של 0.3 לצד הציר של שלושה עד ארבעה עלי ניקוטיאנה חמאמה באמצעות מזרק ללא מחט באתר חיסון T RV אחד. דוקרים את העלים בחיסון של שתי המושבות T RV המתאימות בעזרת קיסם למשך שבועיים. שמרו על הצמחים בטמפרטורה נמוכה עם תזונה נאותה מכיוון שצמיחה נמרצת חשובה להשתקת גנים יעילה על ידי חזירים.

כדוגמה, pseudomonas senge PV tomato T one משמש בניסוי זה. פתוגנים צריכים לשאת פלסמיד שיכול לבטא G-F-P-U-V לגדל את זני ה-PGE במלכים להיות נוזליים, בינוניים בתוספת 10 מיקרוגרם למיליליטר. ריפמפיצין 50 מיקרוגרם למיליליטר יכול מיצין ב-28 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות.

קצרו את תרביות החיידקים על ידי צנטריפוגה, ואז אשרו את נוכחותה של פלואורסצנטיות ירוקה באמצעות מנורת UV באורך גל ארוך בחושך. לאחר שתי שטיפות במים סטריליים, יש להחיות את התאים בריכוז הרצוי של מים סטריליים ולהתאים OD 600. לאחר מכן חסנו את הפתוגנים המתאימים על הצד הצירי של המטרה.

עלים מושתקים גנים מקיפים בקוטר של כ-1.5 סנטימטר במידת הצורך. במקביל בדוק מספר פתוגנים שאינם מארחים לצמיחתם בגן המטרה, צמחים מושתקים כוללים גם בקרת וקטור לצפייה. השתל גידול חיידקי בין יומיים לחמישה ימים.

חשפו את העלים המחוסנים לאור UV באורך גל ארוך בחושך. הקפידו ללבוש הגנה על העור והעיניים. עקוב אחר מושבות החיידקים ככתמים פלואורסצנטיים ירוקים בצד הצירי של העלה ברקע הקרינה האדומה הנפלטת משטח העלה.

ודא את הקרינה הירוקה הנפלטת על ידי הפתוגן המארח הפועל כבקרה חיובית. צפו בצמיחת פתוגן מדי יום בין יומיים לחמישה ימים לאחר החיסון. ערכו רשימה של השיבוטים שהשתיקו, הביאו לצמיחה של פתוגן אחד או יותר שאינם מארחים.

כדי להסיר את התוצאות החיוביות השגויות מהמסך הראשון. חזור על ה-VIGs עבור שיבוטים נבחרים ושוב, בדוק את התגובה של צמחים מושתקים גנטית לפתוגנים ללא עלות. השתמש ב-PCR מושבה על השיבוט שנבחר כדי להגביר את ההכנסה באמצעות A TTB אחד ו-TB שני פריימרים ב-T RV שני וקטור או פריימרים המרוקנים את אתר השיבוט.

הפעל את מוצר ה-PCR על ג'ל aros וודא הגברה של הרצועה הבודדת. לאחר מכן רצף את הכנסת גן הצמח ב-T RV שני וקטור באמצעות פריימרים A TTB או פריימרים המאגפים את אתר השיבוט. בצע פיצוץ באמצעות הרצף וזהה את פרטי הגן.

פרוטוקול כללי להשתקת מספר רב של גנים באמצעות תאנים מבוססות וירוס רעשן טבק בניקוטיאנה. המנה מוצגת בתרשים זרימה זה. חלק מהצמחים שהושתקו הראו שינויים פנוטיפיים שונים, כולל עיכוב בגדילה, הצהבה ופנוטיפים של הלבנת אור.

נתונים אלה מראים פלואורסצנטיות ירוקה של פתוגן שנחשף לאור UV בחושך לפני חיסון הצמח ושתלי הגידול שלהם שלושה ימים לאחר החיסון אותו עלה שנחשף באור לבן מוצג כביקורת. ניסוי זה עוקב אחר הצמיחה של חיידקים המבטאים G-F-P-U-V בפלאנה. שלושה לא מארחים.

פתוגנים שימשו כדי להדגים את תהליך הזיהוי של הצמח המושתק הרגיש לפתוגנים שאינם מארחים בצמחי ניקוטיאנה חמאמה מסוג בר עם חסינות. פתוגנים אלה לא גדלו. עם זאת, לפחות שני פתוגנים שאינם מארחים גדלו על NB sgt.גן

אחד השתיק עלים. נתונים כמותיים על צמיחת חיידקים מדגימים את תהליך זיהוי צמחים מושתקים גנטית שנפגעו בגלל עמידות שאינה ST. באמצעות גישה זו של גנטיקה קדימה בתיווך תאנים, השתקנו כ-5,000 גנים ב-nicotiana hamana וזיהינו צמחים הפוגעים בעמידות ל-non-ST במשך תקופה של כשנה וחצי.

כדוגמה, גידול פתוגנים שאינם מארחים בשני צמחים מושתקים גנים שזוהו ממסך זה מוצג כאן. אנו מקווים להעביר כיצד לבצע השתקת גנים המושרה על ידי וירוסים עבור מאות גנים, ולאחר מכן להעריך את הצמחים המושתקים על ידי התבוננות בגידול של פתוגנים ללא עלות בפלנה כדי לנתח עמידות ללא עלות. על ידי שימוש בגן המושרה על ידי וירוס זה, פרוטוקול מתווך השתקה, ניתן להשתיק מאות גנים בפרק זמן של כשבועיים-שלושה, ולאחר מכן להעריך את צמיחתם של פתוגנים שאינם סוסים המסומנים ב-GFP UV תוך כשעתיים עד שלוש ביום, המשתרעים על פני כיומיים עד חמישה ימים.