שיטת ממטרים השתנה לבודד השתן Exosomes
16 בינואר 2015
כתב יד זה מתאר פרוטוקול לבידוד אקסוזומים משתן אנושי באמצעות טכניקת משקעים שונה.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לתכנן שיטת משקעים אקסוזומית שונה המציעה אלטרנטיבה מהירה, ניתנת להרחבה ויעילה לבידוד אקסוזומים מהשתן. זה מושג על ידי הסרת תאים מתים גדולים ופסולת תאים מדגימת השתן על ידי צנטריפוגה, והחטט המכיל את אקסוזומי השתן מועבר לצינור טרי. בשלב השני, הגלולה מומסת בתמיסת בידוד המכילה DTT כדי להסיר חלבון נפילת סוס TAM.
לאחר צנטריפוגה נוספת, הסופרנטנט נטול ה-TP מודגר עם מגיב TC מהיר אקסו למשך הלילה כדי לזרז את האקסוזומים למחרת. הדגימות שטופלו במגיב TC המהיר של אקסו עוברות צנטריפוגה בפעם האחרונה כדי להשיג את גלולת האקסוזום. בסופו של דבר, ניתן לבצע תהליכים במורד הזרם כגון כתם מערבי ו-QPCR בזמן אמת על האקסוזומים כדי לזהות את הסמנים הביולוגיים המעניינים.
היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו סינון אולטרה צנטריפיקציה ומשקעים הוא ששיטת הזרוע אינה דורשת שלבי הסמכה אולטרה, קלה לביצוע מהירה יחסית, תוך מתן תפוקת אקסוזום גבוהה וטהורה יחסית לניתוח מולקולרי לאחר מכן לפני איסוף השתן. ב -3.125 מיליליטר של קוקטייל מעכב פרוטאז טרי שהוכן לכלי קיבול סטרילי ריק, ולאחר מכן לאסוף כ -10 מיליליטר של שתן ריק ראשון בכלי הקיבול. העבירו את הדגימה לצינורות חרוטיים של 15 מיליליטר.
שימו לב, דגימת שתן של 24 שעות שנאספה יכולה לשמש גם לבידוד אקסוזום על ידי אחסון בארבע מעלות צלזיוס. סובב את הצינורות במשך 10 דקות בטמפרטורה של 17,000 GS ו-37 מעלות צלזיוס כדי להסיר או להפריד פסולת תאית מאקסוזומים בשתן. לאחר מכן, הקפד לא להפריע לגלולה, העביר את הסופרנטנט לצינור טרי והשהה מחדש את הגלולה ב-500 מיקרוליטר של תמיסת בידוד.
דגרו את הגלולה עם DTT בריכוז סופי של 200 מיליגרם למיליליטר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. מערבולת הדגימה כל שתי דקות. לאחר מכן, כאשר הגלולה מומסת לחלוטין, הוסף לדגימה 500 מיקרוליטר של תמיסת בידוד וסובב מיד את המתלה שהתקבל.
אסוף את הסופרנטנט עם הסופרנטנט שנאסף בעבר והשהה מחדש, את הגלולה החדשה ב-50 מיקרוליטר של תמיסת בידוד. כדי שניתוח דף SDS יבודד את האקסוזומים, דגרו תחילה 11 מיליליטר של הסופרנטנט המאוגד עם 3.3 מיליליטר של מגיב TC מהיר אקסו בארבע מעלות צלזיוס למשך 12 שעות לפחות. לאחר צנטריפוגת הדגירה, הדגימה, ולאחר מכן העבירו את הסופרנטנט לצינור טרי לניתוח דף SDS והגלולה המכילה את האקסוזומים בשתן משמשת למיצוי D-N-A-R-N-A או חלבון, או מאוחסנת במינוס 80 מעלות צלזיוס.
השתמש בספקטרופוטומטר NanoDrop כדי לקבוע את ריכוזי ה-DNA וה-RNA של כל מיצוי על ידי מדידת הספיגה ב-260 ו-280 ננומטר עם שני מיקרוליטרים של דגימה כאן. שחזור שונה של ניתוח דף SDS וזיהוי סמנים ביולוגיים באמצעות ניתוח דם מערבי מוצג בנתיבים עם שתן לא מעובד ונצפו איסורי חלבון כדורי השתן הראשונים המתאימים ל-90 עד 100 קילודלטון המצביעים על נוכחות והסרה של חלבון נפילת הסוסים TAM בהתאמה בנתיבי הכדורים הסופיים של הסופרנטנט והאקסוזום. רצועת חלבון נפילת הסוסים TAM לא נצפתה המצביעה על הסרה של חלבון נפילת הסוסים TAM בשלבים המוקדמים יותר וכתוצאה מכך תפוקת כדורי אקסוזום מוגברת.
בניסוי זה זוהו סמנים ביולוגיים אלכס ו-TSG 1 0 1 גם כאשר נעשה שימוש בכמויות נמוכות של דגימה המצביעות על כדור אקסוזום טהור מאוד לניתוח סמנים ביולוגיים והיעדר חלבונים מסיסים בשפע, כולל חלבון נפילת הסוסים TAM לאחר פיתוחו. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום מחלת כליות כרונית להשתמש באקסוזומים מבודדים בשתן לגילוי ואבחון מוקדם של נפרופתיה סוכרתית.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
כתב יד זה מתאר פרוטוקול לבידוד אקסוזומים משתן אנושי באמצעות טכניקת שיקיע מודפית. שיטה זו נועדה לספק חלופה מהירה, ניתנת להרחבה ואפקטיבית לבידוד אקסוזומים.
מרכיבי המחקר המרכזיים
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה
- מחקר אקסוזומים
רקע
- אקסוזומים הם שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות המעורבות בתקשורת בין-תאית.
- בידוד אקסוזומים משתן יכול לספק תובנות לגבי תהליכים ביולוגיים שונים.
- שיטות נוכחיות עשויות להיות גוזלות זמן ופחות יעילות.
- טכניקת שיקוע משופרת עשויה להגביר את השחזור של אקסוזומים.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה מהירה לבידוד אקסוזומים משתן.
- שיפור השליפה והיעילות של הפקת האקסוזומים.
- הספקת יישומים המשך, כגון זיהוי סמנים ביולוגיים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- צנטריפוגציה להסרת תאים גדולים ושאריות מדגימות שתן.
- המסה של המשקע בתמיסת בידוד המכילה DTT.
- דגירה של הנוזל העליון עם ריאגנט exo quick TC למשך לילה.
- צנטריפוגיה סופית לקבלת משקע האקסוזומים.
תוצאות עיקריות
- השיטה המשופרת מבודדת בהצלחה אקסוזומים משתן.
- ניתן להשתמש באקסוזומים לניתוחים המשכיים כגון Western blot ו-qPCR.
- הסרה יעילה של מזהמים משפרת את טוהר האקסוזומים המבודדים.
- הפרוטוקול ניתן להרחבה עבור גדלי דגימות גדולים יותר.
מסקנות
- טכניקת השקיעה המשופרת היא שיטה יעילה לבידוד אקסוזומים.
- גישה זו יכולה לייעל את המחקר על אקסוזומים במגוון מחקרים ביולוגיים.
- מחקרים עתידיים עשויים לבחון יישומים נוספים של אקסוזומים מבודדים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בידוד אקסוזומים משתן מאפשר גילוי לא-פולשני של סמנים ביולוגיים למחלות כליות, ובכך תומך בזיהוי מוקדם ובצמצום סיכונים מכניסטיים בפיתוח טיפולים רנליים. שיטת השקיעה המודגשת מציעה חלופה ניתנת להרחבה ובעלת תפוקה גבוהה לאולטרה-צנטריפוגציה, ובכך משפרת את השחזוריות ואת קיבולת העיבוד עבור תהליכי תיקוף של מטרות. גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי בזיהוי סמנים ביולוגיים על ידי הפחתת זיהומים והגברת טוהר האקסוזומים עבור פרופילינג מולקולרי המשכי.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינת היפותזות טיפוליות באמצעות בידוד אקסוזומים המשקפים מטען ספציפי לסוג התא ממקטעי נפרון.
- ערך תפעולי: מספק שיטה מהירה וניתנת להרחבה לבידוד אקסוזומים ללא צורך באולטרה-צנטריפוגציה, ובכך מפחית את השונות הטכנית.
- ערך חיזוי: מגביר את הביטחון בזיהוי של סמני ביולוגיים (biomarkers) על ידי הפקת משקעי אקסוזומים בטוהר גבוה, המועשירים miRNA ו-mRNA לצורך פרופיל.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- ערך מדעי: הכנת דגימות אקסוזומים שעברו תיקוף לבדיקות המשך, כגון Western blot ו-qPCR, לצורך זיהוי סמנים ביולוגיים הקשורים למחלה.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של בידוד אקסוזומים באמצעות תהליך עבודה מבוסס שיקוע, התואם עיבוד דגימות בהספק גבוה.
- מוכנות לבדיקה: הפקת תנובות אקסוזומים עקביות המתאימות לחילוץ RNA וניתוח חלבונים, התומכות בסריקה הדירה של סמנים ביולוגיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רציפות תרגומית: תומך במעבר מגילוי סמנים ביולוגיים בשתן לוולידציה פרה-קלינית, על ידי אספקת מטען אקסוזומלי רלוונטי למחלה.
- הפחתת סיכונים מכניסטיים: מאפשר זיהוי של תוכן אקסוזומלי משונה תחת תפקוד כלייתי לקוי, ובכך מבהיר נתיבים פתופיזיולוגיים.
- ביטחון חיזוי: מסייע בקבלת החלטות על קידום מותאם-סיכון, על ידי קישור סממנים ביולוגיים אקסוזומליים לסימנים מוקדמים של נפריה סוכרתית.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות ועד לזיהוי מובילים, ומאפשרת בידוד לא פולשני של סמנים ביולוגיים המנחים את בחירת המטרה ואת ההמשכיות הפרה-קלינית.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות על ידי בידוד אקסוזומים המשקפים מטען ספציפי למקור התא מתאי דרכי השתן.
- סריקה: מספק תפוקות אקסוזומית כמותיות וניתנות לשחזור, המתאימות לפיתוח בדיקות לסממנים ביולוגיים ולסריקת תרכובות.
- אנליטיקה: מאפשר מדידה של רמות חלבון ו-RNA הקשורים לאקסוזומים באמצעות qPCR ו-Western blot לצורך ניתוח השוואתי של תנאים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין סממנים ביולוגיים של אקסוזומים משתן לבין מודלים פרה-קליניים של מחלות כליות, באמצעות זיהוי מטען רלוונטי למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמת בידוד סטנדרטית וניתנת להרחבה, הישימה על סוגי דגימות שתן מרובים ותוכניות מחקר שונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: משפר את תיקוף המטרה על ידי הפחתת עמימות מכניסטית באמצעות בידוד אקסוזומים טהורים לצורך פרופיל של סמני ביולוגים.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה והיכולת להרחבה (scalability) על ידי ביטול שלבי אלטרה-צנטריפוגציה ופישוט זרימת העבודה.
- ערך אסטרטגי: תומך בקבלת החלטאות יעילות יותר לגבי המשך פיתוח (go/no-go) על ידי הגברת הביטחון בגילוי מוקדם של סמנים ביולוגים למחלות כליה.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכונים של מועמדים לטיפולים כלייתיים בהתבסס על נתונים חסונים של סממני ביולוגים של אקסוזומים.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בביולוגיה של אקסוזומים ובטכניקות מולקולריות כגון מיצוי RNA ו-qPCR.
- נדרשת גישה לציוד צנטריפוגה, לרכיב ExoQuick TC ולכלים ספקטרופוטומטריים לכימות RNA/DNA.
- נדרשת סטנדרטיזציה בין הצוותים כדי להבטיח זמני דגירה, טמפרטורות וטיפול ברכיבים עקביים.
- נדרש שקלול של התאמות בעת יישום השיטה לפרוטוקולי איסוף שתן או לתנאי אחסון שונים.
- מגבלות מעשיות כוללות את הצורך בדגירה למשך הלילה וטיפול זהיר למניעת אובדן אקסוזומים במהלך העברות.
