שיטות כמותיות לאיתור של הפעלת משלים-Induced נוגדן בתאי דם אדומים
29 בינואר 2014
כאן אנו מתארים שני מבחני למדידת הפעלת משלימים הנגרמת על ידי נוגדנים כנגד תאי דם אדומים. היתרון הגדול על פני מבחני הנוכחיים הוא מטבעם כמוני וקל לפרש.
המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להעריך את הפעלת המשלים על ידי נוגדנים כנגד כדוריות דם אדומות או RBCs בסרום המטופל. זה מושג על ידי דגירה של כדוריות דם אדומות עם סרום המטופל בנוכחות נוגדן חוסם נגד C 5 כדי לגרום לתצהיר C ארבע ו-C3 על פני ה-RBC. לאחר מכן, ה-RBCs מוכתמים בנוגדנים נגד C 4 ו-Anti C3 המסומנים פלואורסצנטית, ולאחר מכן ניתן לנתח את כמות שקיעת המשלים על ה-RBCs על ידי זרימה ציטומטרית בשיטה חלופית.
תאי הדם האדומים מודגרים בסרום המטופל בהיעדר אנטי C חמש כדי לגרום לליזה מתווכת משלים. לאחר מכן ניתן לקבוע את אחוז ה-RBCs שעברו ליזה על ידי מדידת כמות ההמוגלובין המשתחרר על ידי התאים על ידי ספקטרומטריה. היתרון העיקרי של טכניקה חדשה זו על פני שיטות קיימות כמו המוליזה או בדיקת אנטיגלובולין המשמשת באבחון שגרתי הוא שהיא כמותית באופייה ואנו יכולים לזהות הבדלים לא אופטימליים בהפעלת המשלים.
אליזבת ברוק, פוסט-דוקטורנטית במעבדה שלנו, תדגים נהלים: התחל בשטיפת תאי דם אדומים מסוג אפס שלוש פעמים עם PBS, ולאחר מכן דגר את הגלולה בתמיסת נתיב רומא של 0.5% ביחס של אחד לשניים למשך 10 דקות ב-37 מעלות צלזיוס לאחר שטיפת התאים שלוש פעמים נוספות, אחסן אותם כתמיסה של 3% ב-PBS טרי בארבע מעלות צלזיוס כדי לנתח את שקיעת המשלים על ה-RBCs על ידי זרימה ציטומטרית. ראשית, יש לנטרל את הכמות הרצויה של סרום המטופל למשך 30 דקות בטמפרטורה של 56 מעלות צלזיוס בזמן שהסרום מטופל בחום. שטפו את כדוריות הדם האדומות שטופלו בברולה שלוש פעמים במאגר רואל לאחר השטיפה האחרונה.
Resus השעו את הגלולה ב-vbg פלוס פלוס בדילול של 0.5%. לאחר מכן בפנינת זכוכית 25 מיקרוליטר של 0.5% RBCs, 37.5 מיקרוליטר של סרום AB טרי ו-37.5 מיקרוליטר של 200 מיקרוגרם למיליליטר, אנטי C חמישה לכל באר של צלחת תחתונה עגולה של 96 בארות. לאחר מכן הוסף את סרום המטופל המומת בחום לכל באר בריכוז המתאים, השלם עם סרום AB מומת בחום לפי הצורך וכולל גם בקרה שלילית.
השתמש ב-VBG plus plus כדי להביא כל באר לנפח סופי של 150 מיקרוליטר ולאחר מכן דגר את הצלחת המכוסה בנייר כסף E IA למשך שעה וחצי עד שעתיים ב-37 מעלות צלזיוס עם ניעור לאחר הדגירה. שטפו את התאים שלוש פעמים עם PBS בתוספת 0.5% BSA, ולאחר מכן תייגו את התאים במיקרוגרם אחד למיליליטר. ארבעה נוגדנים חד-שבטיים המסומנים בפלואורסצנט נגד C3 ואנטי C דוגרים על התאים למשך 30 עד 45 דקות בטמפרטורת החדר עם ניעור עדין, ולאחר מכן לאחר שטיפת הצלחת שלוש פעמים, משהים מחדש את תאי הדם האדומים ב-150 מיקרוליטר PBS בתוספת 0.5% BSA לכל אחד.
ובכן העבירו את מתלי התאים לצלחת תחתונה עגולה חדשה של 96 באר, ואז העמיסו את הצלחת על ציטומטר הזרימה, הפרידו את התאים הבודדים מהכפולות באמצעות עלילת פיזור קדימה. הגדר את השער על ה-RBCs הבודדים ולאחר מכן בחר את ערוץ הזיהוי המתאים עבור האותות הפלואורסצנטיים. כמת את התוצאות באמצעות עוצמת הקרינה החציונית לניתוח המוליטי כמותני, חמם והפעל את סרום המטופל ושטוף את ה-RBCs שטופלו ברומיין כפי שהודגם זה עתה.
לאחר מכן לאחר הדגירה של תאי הדם האדומים עם משלים וסרום מטופל כפי שהודגם זה עתה, אך ללא האנטי C 5, סובב את התאים למשך חמש דקות ב-664 GS עם האטה מופחתת. לאחר מכן, העבירו בזהירות 90 מיקרוליטר של סופרנטנט ללוחית מיקרוטיטר חדשה, הקפידו לא להעביר את התאים השלמים ולהימנע מיצירת בועות אוויר, ולאחר מכן מדדו את הספיגה בארבע 14 עד שש 90 באקספרס ספקטרופוטומטר. ההמוליזה כאחוז מהליזה של דגימה של תאי דם אדומים שהודגרו במים טהורים.
באיור ראשון זה, ניתן לראות כאן תרשימי פיזור מייצגים עבור RBCs שטופלו בברולה שער מתאים ל-RBCs בודדים. בדרך כלל, כ-95% מה-RBCs נופלים בתוך שער התא היחיד הזה. בהיסטוגרמות אלה תוצאות מייצגות את ההשפעה של אנמיה המוליטית אוטואימונית או AHA.
סרום המטופל בתצהיר C 4 ו-C3 מוצג כצפוי, יותר סרום מטופל מוביל ליותר שקיעה משלימה. באופן מוזר, שקיעת המשלים מתרחשת בשתי פסגות חיוביות נפרדות. זה כנראה לא נגרם על ידי הטרוגניות באוכלוסיית ה-RBC מכיוון שה-RBCs נלקחים מתורם יחיד, למרות שהגורם לתופעה עדיין נחקר, עוצמות הקרינה החציונית של הדגימות משורטטות בגרפים קוויים אלה כדי להראות את יכולת השחזור של מבחני התצהיר C four ו-C3.
שימו לב לשונות הרחבה בתצהיר של דגימות חולי AH H השונות. לבסוף, ניתן לראות נתונים מבדיקה המוליטית של דגימת סרום של מטופל ahha המכילה נוגדנים עצמיים ל-RBCs בגרפים אלה. טיטרציה עם דגימת הסרום מניבה עקומה ברורה הניתנת לשחזור עם מעכב משלים מתאים כגון אנטי C five.
ניתן לטטר את האות המוליטי כפי שמודגם בגרף זה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד למדוד את הפעלת המשלים על ידי נוגדנים ספציפיים לתאי דם אדומים, בין אם על ידי ניתוח זרימה ציטומטרי של תצהיר C3 או C ארבע או על ידי בדיקה המוליטית כמותית.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר שתי בדיקות למדידת הפעלת מערכת המשלים המושרית על ידי נוגדנים נגד תאי דם אדומים (RBCs). הבדיקות הן כמותיות וקלות לפירוש, ובכך הן מספקות יתרונות על פני שיטות קיימות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- אימונולוגיה
- המטולוגיה
- ציטומטריה עם זרימה
רקע
- הפעלת המשלים היא קריטית בתגובות חיסוניות.
- נוגדנים נגד תאי דם אדומים עלולים להוביל למצבים קליניים שונים.
- ייתכן שחסרה בדיקות הנוכחיות דיוק כמותי.
- שיטות חדשות שואפות לשפר את הגילוי של הפעלת המשלים.
מטרת המחקר
- להערכת הפעלת המשלים על ידי נוגדנים נגד תאי דם אדומים (RBCs).
- לפיתוח בדיקה כמותית לצורך פרשנות טובה יותר של התוצאות.
- להשוואת טכניקות חדשות עם שיטות אבחון קיימות.
שיטות שהשתמשו בהן
- דגירה של RBCs עם סרום של המטופל ונוגדנים חוסמים.
- צביעה של RBCs באמצעות נוגדנים המסומנים פלואורסצנטית.
- ניתוח של שיקוע משלים באמצעות ציטומטריית זרימה.
- מדידת שחרור המוגלובין לקביעת ליזיס של RBCs.
תוצאות עיקריות
- הבדיקות החדשות מספקות נתונים כמותיים על הפעלת המשלים.
- ניתן לזהות הבדלים תת-אופטימליים בהפעלה.
- התוצאות מראות רגישות משופרת בהשוואה לשיטות מסורתיות.
- ניתוח בציטומטריית זרימה מאפשר פרשנות מפורטת.
מסקנות
- הבדיקות החדשות משפרות את ההבנה של הפעלת המשלב (complement activation).
- הן מציעות חלופה מהימנה לבדיקות אבחוניות קיימות.
- יישומים עתידיים עשויים לשפר את האבחון והטיפול בחולים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הערכה כמותית של הפעלת המשלים המושרית על ידי נוגדים בתאי דם אדומים היא קריטית להערכת יעילותם של מעכבי משלים ולהבנת מנגנוני המוליזה בהפרעות אוטואימוניות ואלו-אימוניות. בדיקות הסייטומטריה והספקטרופוטומטריה המתוארות מספקות תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור, המאפשרות זיהוי של הבדלים תת-אופטימליים בהפעלת המשלים, ובכך תומכות בהפחתת סיכונים מנגנונית בפיתוח תרופתי. שיטות אלו משפרות את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי תרגום תצפיות איכותניות לסמנים ביולוגיים מדידים וניתנים לתרגום לצורך קבלת החלטות בשלבים הפרה-קליניים והקליניים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי כימות של שיקוע קומפלימנט (C3/C4) המושרה על ידי אוטואנטיגנים או אלואנטיגנים על RBCs.
- ערך תפעולי: מספק תיקוף פונקציונלי של המטרה באמצעות מדידה ישירה של פעילות אפקטורית המתווכת על ידי נוגדנים, ובכך מפחית עמימות מכניסטית בבחירת המטרה.
- ערך חיזוי: תומך בתעדוף תיקי פיתוח באמצעות הפקת נתונים כמותיים על עוצמת הפעלת הקומפלימנט, ומספק בסיס להחלטות המשך (go/no-go) עבור תרופיות מווסתות קומפלימנט.
סקר ופיתוח בדיקות (Assay)
- מוכנות הבדיקה: מייצרת תוצרים כמותיים וסטנדרטיים (עוצמת פלואורסצנציה חציונית, שחרור המוגלובין) המתאימים לסריקה בייצור גבוה (high-throughput screening) של מעכבי קומפלימנט או נוגדנים טיפוליים.
- שחזוריות: מראה שונות נמוכה בין דגימות סרום של מטופלים, מה שמאפשר הערכה אמינה של תרכובות וסטנדרטיזציה בין מעבדות.
- תועלת הפלטפורמה: משתמשת במכשור נגיש (ציטומטר זרימה, ספקטרופוטומטר) ליצירת בדיקות ניתנות לשימוש חוזר למדידת פעילות ביולוגית תלוית-קומפלימנט בתהליכי גילוי תרופות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מדמה מנגנונים פתופיזיולוגיים באנמיה המוליטית אוטואימונית (AIHA) והמוליזה אלואימונית, ומקשר בין מעורבות המטרה להפעלה תפקודית של המשלים.
- המשכיות תרגומית: מגשר בין שלב הגילוי לתיקוף פרה-קליני באמצעות אספקת סממנים ביולוגיים כמותיים (שקיעת C3/C4, המוליזה) המתואמים עם פוטנציאל המוליטי קליני.
- קידום מותאם סיכונים: מאפשר הפחתת סיכונים מנגנונית באמצעות כימות ליזיס המתווך על ידי המשלים, ובכך מספק מידע להערכות בטיחות ולמידול תגובת-מינון במחקרים פרה-קליניים.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
הבדיקות משתלבות ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה דרך זיהוי מובילים ועד להערכת בטיחות פרה-קלינית, ומספקות מדדים כמותיים של הפעלת המשלים התורמים להפחתת סיכונים ביולוגיים ולהערכת האינדקס הטיפולי.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות על ידי כימות מסלולי הפעלת המשלים המושרים על ידי נוגדנים, ובכך מבהיר את מנגנון הפעולה של מועמדים לאימונומודולציה.
- סריקה: מספק פלטים כמותיים המוכנים לבדיקה (עוצמת פלואורסצנציה, המוליזה ספקטרופוטומטרית) המאפשרים השוואה מהימנה בין תרכובות בדיקה או דגימות סרום.
- אנליטיקה: מייצר קריאות מדידות (עוצמת פלואורסצנציה חציונית, שחרור המוגלובין) המקלות על ניתוח סטטיסטי והשוואה בין תנאים במחקרי תגובה למינון.
- מחקר תרגומי: מקשר לרציפות פרה-קלינית באמצעות פלטים רלוונטיים למחלה המשקפים את הפעלת המשלים הנראית ב-AIHA ובמצבי עירוי.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה סטנדרטית וניתנת להרחבה להערכת פעילות תלוית-משלים במגוון תרופות נוגדנים, ביו-סימילארים ומעכבי משלים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי בתיקוף המטרה על ידי המרת בדיקות משלימה איכותניות למדידות כמותיות הניתנות לתרגום.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות והסטנדרטיזציה באמצעות פרוטוקולים מוגדרים להכנת RBC, דגירה של סרום וזיהוי באמצעות ציטומטריית זרימה או ספקטרומטריה.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי מתן אפשרות לזיהוי מוקדם של חסרונות המפעילים את המערכת המשלימה, ובכך מפחית את הסיכון לכישלון בשלבים מאוחרים בתוכניות של אימונומודולציה.
- השפעה על הפורטפוליו: מסייע בתעדוף מותאם סיכון על ידי כימות פוטנציאל הפעלת המערכת המשלימה, ובכך תומך בהחלטות קידום אובייקטיביות בפיתוח טיפולי.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות באימונולוגיה, ציטומטריית זרימה וביצוע בדיקות ספקטרופוטומטריות למדידה מדויקת של שיקוע קומפלימנט והמוליזה.
- תלוי בגישה לציטומטרים של זרימה עם ערוצי פלואורסצנציה מתאימים ולספקטרופוטומטרים לצורך כימות המוגלובין ב- 414/690 nm.
- מחייב סטנדרטיזציה של הכנת תאי RBC (למשל, מסוג zero, מטופלים ב-bromelin) ואינאקטיבציה של סרום בחום כדי להבטיח עקביות של הבדיקה בין משתמשים ואתרים שונים.
- נדרש שיקול של התאמות בעת היישום על מיני RBC שונים, צפיפויות אנטיגן שונות, או מקורות קומפלימנט שאינם סרום אדם מסוג AB.
- מגבלות מעשיות כוללות את הצורך בהעברה זהירה של הסופרנאט כדי למנוע מעבר של תאים ובועות אוויר, העלולים להשפיע על דיוק כימות ההמוליזה.
