מדידת שינויים במגע רגישות בכף הרגל האחורית של עכברים באמצעות מנגנון אלקטרוני פון פריי
19 בדצמבר 2013
מדידות פון פריי אלקטרוניות הן אלטרנטיבה יעילה ומשופרת לחוטי פון פריי הקלאסיים, מכיוון שהן מאפשרות מדידה מהירה ומדויקת של שינויים בספי הנסיגה המכאניים של מכרסמים לגירוי לחץ המופעל ברציפות לפני ואחרי אירוע דלקתי.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לא למדוד תגובות רגישות ללחץ מכני בכף האחורית של עכברים. זה מושג על ידי הנחת החיות תחילה על רצפת רשת תיל ומתן אפשרות להתרגל כשהן מוכנות. קצה פוליפרופילן מוחל על החלק התחתון של הכפה האחורית, והלחץ מוגבר בהדרגה.
כאשר מציינים את התגובה ההתנהגותית המתאימה, הגירוי נסוג. לאחר איסוף ערכי הבסיס, החיות מקבלות התערבות ניסיונית לפני בדיקות נוספות. בסופו של דבר, שינויים בסף הנסיגה של כפות הרגליים האחוריות מושווים בין קבוצות הטיפול כדי לקבוע את ההשפעה של טיפול מסוים על שינויים ברגישות המישוש ללחץ.
כאב הוא מרכיב קרדינלי של דלקת. חשוב למדוד ולאפיין כאב בהקשרים שונים. ניתן ליישם שיטה פשוטה יחסית זו של הערכת כאב על מודלים רבים ושונים של דלקת.
מי שתדגים את ההליך היא טיאנה אוב, טכנאית מחקר במעבדה שלי, מדיסון מאק, שהייתה מעורבת בעבודה זו כסטודנטית לתואר ראשון ואקילה סייקס. כרגע סטודנטית לתואר ראשון במעבדה שלי. התחל בהגדרת מכשיר הבדיקה לגישה נוחה לכפות האחוריות.
הניחו תאים בודדים על גבי רצפת רשת. רצפת הרשת צריכה להיות בגובה נוח ועל משטח יציב. לאחר מכן, הנח את מכשיר פון פריי האלקטרוני על הספסל.
ודא שהגשושית והכבל מחוברים כראוי ליחידת התצוגה והפעל את המכשיר במצב ההגדרה. הגדר את הקריאה לאפס והנח בעדינות את משקל הבדיקה שסופק על החרוט של בדיקת פון פריי. הקלט את הקריאה וחזור על הליך זה שוב בתום הבדיקה, אם יש אי התאמה בין שני הערכים, ייתכן שיהיה צורך לכייל מחדש את המכשיר.
בחר קצה פוליפרופילן בגודל המתאים לרקמה לבדיקה. טיפים קשיחים עובדים היטב עבור רקמת כף הרגל האחורית הפחות רגישה והקשוחה יותר. הרכיב בעדינות את הקצה על חרוט הגשושית.
לאחר מכן עבור ממצב הגדרה למצב פעולה. זה יציג את הלחץ המרבי המופעל כאשר הגשושית נסוגה. יש צורך בשני חוקרים כדי למדוד את סף נסיגת הכפות האחוריות.
האחד, להפעיל את המכשיר ולבצע את המדידות, והשני לתעד את המדידות הללו על מנת להפחית את ההטיה. החוקר המפעיל את ה-TER המרדים צריך להיות עיוור לטיפולים כמו גם לערכי סף הנסיגה המתועדים. יתר על כן, כדי להבטיח עקביות בין המדידות, אותו אדם צריך לרשום את כל ערכי סף הבסיס והנסיגה.
48 שעות לפני הטיפול, נרשמת הסט הראשון של מדידות הבסיס. הנח חומר סופג מתחת למעמד כדי לאסוף פסולת מופרשת. לאחר הרכבת הקצה ואיפוס הגשושית, הנסיין המתעד את המדידות צריך למקם את העכברים בתאים בודדים.
מכסים את התאים במכסים מחוררים, ומניחים מעל חפץ כבד. כדי למנוע מהעכברים לברוח, אפשר לעכברים להתאקלם בתא למשך 15 דקות לפני שתמשיך. בדרך כלל, אנשים חדשים בטכניקה זו יתקשו עם יישום הדרגתי של לחץ מוגבר, ועם ביסוס עקביות פנימית עם המדידות שלהם, תרגול חיוני ליצירת תוצאות הניתנות לשחזור.
כשהוא מוכן, השתמש בשתי ידיים כדי להרים את הגשושית לאט ולעורר את כרית כף הרגל של הכף האחורית השמאלית או הימנית. הגדל את הלחץ בהדרגה עד שנצפית התנהגות נוסיספטיבית. אלה מזוהים על ידי נסיגת כפות אחוריות, ליקוק כפות אחוריות או לקפיצת כפות.
הנחו את החוקר השני לתעד את הלחץ שעורר את ההתנהגות שנצפתה. בזמן המדידה כדאי לעודד את העכבר להחזיק בשקט על ידי הנחת חיך מזון ממש מחוץ לחדר או השמעת רעש קל כגון הקשה עדינה לפני ביצוע המדידה. המשך לעכבר הבא עד שכל אחד מהם נבדק פעם אחת וחזור על הליך זה ארבע פעמים נוספות.
לאחר איסוף חמישה ערכי בסיס, קבל ממוצע עבור כל עכבר. חזור על מדידות הבסיס 24 שעות לאחר מכן והשתמש בערכים אלה כדי לחשב ממוצע אחר. כדי להבטיח שלכל העכברים יש תגובות בסיס עקביות, אל תכלול בעלי חיים עם סף נסיגה ממוצע מתחת ל-3.5 גרם או עם סף בסיס שונה בשני גרם או יותר.
לבסוף, הקצה עכברים לקבוצות טיפול נפרדות כך שקו הבסיס הממוצע של כל אחד מהם יהיה דומה ככל האפשר כאן, ספי הנסיגה נמדדו לאחר כף הרגל האחורית, מתן הארס, ROS raca. בקרה מטופלת במי מלח. עכברים הראו שינוי מועט בהשוואה לקו הבסיס בכל הזמנים.
נקודות שנבדקו תגובות נוסיספטיביות בעכברים שטופלו נשמרו בבירור עד שש שעות. בנוסף, בצקת רקמות, האופיינית לדלקת, ניכרה בארס, אך לא בכפות האחוריות שטופלו במי מלח. שינויים שנגרמו על ידי ארס ברגישות המישוש לוו בזרם נויטרופילים של כמעט פי 1000.
בהשוואה לכפות הרגליים האחוריות שטופלו במי מלח בכפות שטופלו במי מלח, תאי הפיטום הפלנטרי ברקמת הכף האחורית היו שלמים ברובם או הראו דה-גרנולציה קלה. לעומת זאת, בחלק האחורי המזווג הראה דגרנולציה מתונה ונרחבת של 15 עד 20% של תאי פיטום. ניתן להתאים טכניקה זו להערכת רגישות מכנית או מישוש במגוון רחב של רקמות מלבד הכף האחורית.
לכן, ניתן לשלב טכניקה זו במודלים רבים ושונים של מכרסמים של דלקת וכאב.
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה למדידת תגובות נוציצפטיביות ללחץ מכני בכף הרגל האחורית של עכברים באמצעות מדידות von Frey אלקטרוניות. טכניקה זו מאפשרת הערכה מהירה ומדויקת של שינויים בספי רפלקס נסיגה מכני לפני ואחרי התערבויות דלקתיות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- הערכה התנהגותית
- מודלים של דלקת
רקע
- מדידת כאב היא קריטית להבנת דלקת.
- מכשיר von Frey אלקטרוני מציע יתרונות על פני שיטות קלאסיות.
- מדידה מדויקת של ספי תגובת נסיגה חיונית לשחזור התוצאות.
- ניתן להתאים שיטה זו למודלים שונים של מכרסמים.
מטרת המחקר
- להערכת רגישות מכנית בתגובה לגירויי לחץ.
- להערכת השפעות של טיפולים על התנהגות נוציצפטיבית.
- לביסוס שיטה אמינה להערכת כאב במחקר.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הרגלה של עכברים על רצפת רשת מתכת.
- הפעלת לחץ הדרגתית באמצעות טיפ פוליפרופילן.
- תיעוד של ספי רף נסיגה על ידי שני חוקרים מסוככים.
- השוואה בין מדידות הבסיס למדידות לאחר הטיפול.
תוצאות עיקריות
- נצפו שינויים משמעותיים בספי סף הנסיגה לאחר הטיפול.
- הדלקת אופיינה בבצקת רקמות ובזרימה של נויטרופילים.
- דה-גרנולציה של תאי מאסט השתנתה בין קבוצות הטיפול.
- השיטה הפגינה התאמה לרקמות שונות.
מסקנות
- שיטת von Frey האלקטרונית יעילה להערכת כאב במכרסמים.
- טכניקה זו יכולה להגביר את ההבנה של מנגנוני כאב דלקתי.
- היא מספקת בסיס למחקרי עתיד על כאב ויעילות טיפולית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתיתי לדרג ניהולי
הערכת שינויים ברגישות למגע במודלים של מכרסמים מספקת נתונים קריטיים בשלב מוקדם לצורך תיקוף של מטרות אנלגזיות והפחתת סיכונים מכניסטיים בפיתוח תרפיה לכאב. שיטת von Frey האלקטרונית מאפשרת מדידה כמותית ומהירה של ספי סף לנסיגה מכנית, ובכך תומכת בהערכה פרה-קלינית הדירה של מודלים לכאב דלקתי וכאב נוירופתי. גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי במעורבות המטרה ובאתילת הטיפול לפני קידום תרכובות לשלבי מחקר מאוחרים יותר.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות הקשורות למסלולים נוציצפטיביים ומנגנוני ויסות של כאב.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי אספקת מדדים כמותיים ומבוקרי-פנימיים של רגישות מגע על פני קבוצות טיפול שונות.
- ערך ניבוי: מסייע במיון תיקי פיתוח באמצעות השוואה אובייקטיבית בין ספי רגישות למגע בנקודת ההתחלה ולאחר ההתערבות, לצורך הערכת ויסות המטרה.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- מוכנות הבדיקה: מכינה מערכות ביולוגיות עוברות תיקוף לסריקה המשכית על ידי קביעת מדידות בסיס סטנדרטיות של רגישות תחושתית.
- שחזוריות: מאפשרת מדידות עקביות וחוזרות בפרקי זמן קצרים, ובכך תומכת בסטנדרטיזציה של הבדיקה ובהשוואה בין קבוצות.
- מדרגיות: מאפשרת מספר מדידות לכל נבדק, מה שמגביר את התפוקה ואת המהימנות עבור קמפיינים של סריקת תרכובות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מדמה אלודניה מכנית המושרה על ידי דלקת, בהתאמה לפנוטיפים קליניים של כאב במצבים דלקתיים ונוירופתיים.
- המשכיות תרגומית: מגשר בין שלבי הגילוי למסלולי העבודה הפרה-קליניים על ידי אספקת תוצאות מדידות של רגישות לכאב הרלוונטיות מבחינה מכניסטית.
- קידום מותאם סיכון: מספק בסיס להחלטות go/no-go בהתבסס על שינויים הניתנים לשחזור בספי סף הנסיגה בעקבות התערבויות ניסיוניות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
שיטת von Frey האלקטרונית משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה, דרך זיהוי מובילים ועד לבדיקת יעילות פרה-קלינית, ובמיוחד עבור תרכובות מווסתות כאב.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות ובבירור מסלולים על ידי מדידת תגובות נוציצפטיביות ללחץ מכני כמדד תפקודי למעורבות המטרה.
- סריקה: מספקת פלטיים כמותיים הניתנים לשחזור ומוכנים לבדיקה, החיוניים להערכה אמינה של תרכובות במודלים של כאב.
- אנליטיקה: מספקת מדידות מדויקות של סף נסיגה ויכולת השוואה סטטיסטית בין תנאי הבסיס לתנאי הטיפול.
- מחקר תרגומי: מקשר לתיקוף פרה-קליני באמצעות תוצאות רגישות מכנית רלוונטיות למחלה במודלים של דלקת.
- שימוש חוזר ארגוני: משמשת כיכולת פלטפורמה הניתנית לשימוש חוזר במגוון מודלים של כאב דלקתי ונוירופתי, ובכך מפחיתה פיתוח כפול של בדיקות.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת העמימות המכניסטית בוויסות נתיבי כאב.
- ערך תפעולי: מספק מדידות סטנדרטיות וניתנות לשחזור של רגישות מגע עם שונות טכנית מינימלית.
- ערך אסטרטגי: משפר את איכות קבלת ההחלטות לגבי המשך הפיתוח (go/no-go), ובכך מגביר את יעילות ההון ומפחית נשירה בשלבים מאוחרים עקב חוסר יעילות המתווכת על ידי המטרה.
- השפעה על פורטפוליו: מאפשר תיעדוף תרכובות מבוסס סיכון על בסיס השפעות כמותיות על ספי סحب מכני.
שיקולי יישום
- נדרש אימון בתצפית התנהגותית ובזיהוי תגובות נוציספטיביות כדי להבטיח עקביות במדידות.
- תלוי במכשיר von Frey אלקטרוני מכויל ובבחירה נכונה של חוד polypropylene המתאים לרקמות כף הרגל האחורית.
- מחייב ביצוע עיוורון (blinding) של המפעילים והרושמים לגבי תנאי הטיפול, כדי למזער הטיות ברישום הסף.
- כולל קריטריוני החרגה המבוססים על שונות בסף הבסיס, כדי להבטיח הומוגניות של הקבוצות ושלמות הנתונים.
- מוגבל לתגובות התנהגותיות מדידות; מחייב נקודות קצה נוציספטיביות ברורות, כגון הרמת כף הרגל, ליקוק או קפיצה.
