ביטוי, בידוד וטיהור של מסיס ובלתי מסיסים חלבונים Biotinylated להתחדשות רקמת עצב

המטרה הכוללת של הליך זה היא לתכנן, לבטא ולבודד בהצלחה חלבונים ביוטיניליים רקומביננטיים שניתן לשלב במגוון יישומים כגון בדיקות, חיישנים, אספקת תרופות והנדסת רקמות. זה מושג על ידי הפיכת הפלסמיד המעוצב בהתאמה אישית לקו תאים מארח חיידקי באמצעות תרביות בקנה מידה קטן, ולאחר מכן גרימת ביטוי של חלבון המטרה. לאחר מכן, הנוכחות והמסיסות של חלבון המטרה נקבעת על מנת לגבש הליכי טיהור נאותים.

לאחר מכן ההליך מוגדל, כדי לייצר תשואות גדולות יותר של חלבון המטרה, אשר מבודדות לאחר מכן באמצעות טכניקות כרומטוגרפיה של זיקה. לבסוף, החלבונים מטוהרים ולאחר מכן מרוכזים ליישומים וניתוחים במורד הזרם. בסופו של דבר, תוצאות דף SDS ו-FPLC מאמתות כי חלבונים רקומביננטיים בודדו וטוהרו בהצלחה, והחלבונים נבדקים עוד יותר לפונקציונליות.

היתרון העיקרי של הנדסת חלבונים רקומביננטיים הוא שהיא מאפשרת לנו ליצור כמויות גדולות או בקנה מידה של מיליגרם של חלבונים שתוכננו בהתאמה אישית כדי לעמוד במפרט המדעי המדויק שלנו. לדוגמה, אנו יכולים להוסיף פונקציות חדשות לחלקים של חלבונים אלה כדי לאפשר תכונות חדשות. אנו נראה לכם היום כיצד ניתן ליצור ביוטין בקצוות של חלבונים ספציפיים, ואנו משתמשים בזה כדי לשתק או לקשור את החלבונים הללו למשטחים כדי להנחות תפקודים תאיים כגון צמיחה עצבית או התמיינות עצבית.

אנשים חדשים בטכניקה זו לא אמורים להתקשות במיוחד בעת ביצוע ההליכים לבידוד חלבון מקומי או לא מקומי. שלבים רבים זהים, אך דורשים מאגר ספציפי שפותח עבור תנאים מקוריים או לא מקוריים. תשומת לב קפדנית לפרטים במהלך ההתחלה.

שלבי הטרנספורמציה וביטוי הבדיקה יבטיחו תפוקת חלבון גבוהה במהלך תהליך ההגדלה הסופי המאוחר יותר. הדגמה חזותית של שיטה זו חשובה מכיוון שהיא מראה כיצד ניתן לייצר חלבונים רקומביננטיים באמצעות ציוד מעבדה ואספקה פשוטים. תוך ניצול תגובת האצווה הפשוטה, השוויון ואמצעי הגידול גדלים בקנה מידה מוביל, ומייצרים 10 מיליגרם חלבון לתרבית עיקרית.

בנוסף, ניתן להשתמש בטכניקות כרומטוגרפיה ולהדגים כדי להראות כיצד חלבונים מטוהרים עוד יותר ליישום במורד הזרם היום, אליסיה, בוגרת מעבדת הקולנוע תדגים את ההליך לאחר שיבוט ובדיקת ביטוי בחלבון המטרה המעניין, וגידול תרבית של 20 מיליליטר בן לילה. על פי פרוטוקול הטקסט, שפכו את תרבית הלילה לתוך 1.8 ליטר של מדיום גידול סטרילי עם אמפיצילין והשתמשו בפיפטה פסטר כדי להוסיף שש עד שמונה טיפות של תרביות אנטי קצף סטריליות 2 0 4 לתוך אמבט מים של 37 מעלות צלזיוס דרך פילטר 0.2 מיקרון, בועות אוויר דחוס לתרביות דרך אבני אוורור. כאשר התרבית מגיעה ל-OD 600 של 0.7 עד 0.8 ב-IPTG מילי-מולרי אחד ולגרום לה למשך ארבע שעות ב-37 מעלות צלזיוס או לילה ב-18 מעלות צלזיוס, תלוי אם החלבון נמצא בחלק המסיס או הבלתי מסיס בביטוי הבדיקה.

ניסויים לאיסוף התאים, העברת התרבית לבקבוקי צנטריפוגה של ליטר אחד וסובב אותה במשך 15 דקות בכוח הכבידה פי 14,000 וארבע מעלות צלזיוס. יוצקים את הסופר נאטין ובעזרת מרית דקה, גורפים את כדור החיידקים לשני צינורות של 50 מיליליטר. גלולה את התאים שוב על ידי צנטריפוגה למשך מספר דקות לפני אחסון הכדורים במינוס 80 מעלות צלזיוס.

לבצע חלבון שאינו מקורי. בידוד לחלבון בלתי מסיס לכל כדור אי קולי קפוא. הוסף 20 מיליליטר של ליזה, מאגר כביסה ומערבולת ונער כדי להשעות מחדש כדי לחסל נתחים גדולים.

לאחר הדגירה על מוטטור למשך הלילה, התמיסה תיראה כמו צנטריפוגה צמיגה. התרחיץ בכוח הכבידה פי 20, 500 וטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. העבירו את הסופרנטנט לצינור טרי והשליכו את הגלולה לבידוד חלבון מקומי.

Resus השעו את הכדורים במאגר ליזה בנפח סופי של 30 מיליליטר עם הכדור התלוי על הקרח. הגדר את הסוניקט על משרעת של 30% עם דופק של 30 שניות על 30 שניות כבוי, וסוניקט למשך חמש דקות. נדנוד הצינור למעלה ולמטה במהלך סוניקציה כדי לפרק לחלוטין את גלולת התא.

צנטריפוגה את התרחיץ בכוח הכבידה פי 20, 500 וארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר מכן העבירו את הסופרנטנט לצינור טרי והשליכו את הגלולה. כדי לבצע כרומטוגרפיה של זיקה על חלבון מבודד שאינו ילידי, הוסף מיליליטר אחד של תמיסת שרף ניקל NTA לכל צינור צנטריפוגה ודגר על מוטטור או שייקר בטמפרטורת החדר למשך שעה לפחות.

יוצקים את התרחיץ לתוך עמוד זיקה ומאפשרים לתמיסה לטפטף דרך שסתום זין העצירה לחלוטין לתוך כוס פסולת. הוסף 10 מיליליטר של מאגר כביסה לצינור הצנטריפוגה כדי להסיר שרף שיורי ולהוסיף את התמיסה לעמודה לאחר שהתמיסה טפטפה דרכה. השתמש במוט ערבוב זכוכית כדי לערבב את השרף ולאפשר לו לסיים לטפטף לפני הוספת שטיפה נוספת.

לאחר מכן, השתמש ב -10 מיליליטר של מאגר כביסה כדי לחזור על שטיפת צינור הצנטריפוגה ולהעביר אותו לעמודה. לאחר מכן בצע שמונה כביסות נוספות של העמוד עם 10 מיליליטר מאגר שטיפת ליזה לכל שטיפה. לאחר השלמת השטיפות, סגור את זין העצירה והחלף את כוס הפסולת בצינור הצנטריפוגה של 50 מיליליטר.

הוסף 15 מיליליטר חיץ אלוציאני לעמוד, ערבב את השרף ואפשר לתמיסה לשבת במשך חמש דקות. לאחר מכן פתח את זין העצירה ואסוף את ה-EIT לפני שתחזור על הפעולה עם 15 מיליליטר נוספים של מאגר פליטה לטיהור חלבון מקומי. לאחר הוספת שרף הניקל NTA לתמיסת החלבון, מודגר על מוטטור בארבע מעלות צלזיוס למשך שעה לפחות.

לאחר שימוש במאגר כביסה לשטיפת העמודה 10 פעמים, הוסף חמישה מיליליטר של מאגר פליטה ודגר את השרף למשך חמש דקות לפני השימוש בצינור טרי כדי לאסוף את רוב ה-EIT בזמן שה-EIT מטפטף מהעמודה, הוסף 90 מיקרוליטר לבאר של מגיב ברדפורד לצלחת שקופה של 96 בארות. לאחר כל חמישה מיליליטר אלוציאן עם חיץ, אפשר ל-10 מיקרוליטר של תמיסה לטפטף מהעמוד לבאר המכילה 90 מיקרוליטר של מגיב ברדפורד. המשך עם ה-EEU עד שלא יתגלה עוד חלבון לדיאליזה או רנה.

החלבונים מעבירים כל EIT לצינורות דיאליזה ומבצעים דיאליזה כנגד המאגר המתאים, אחד למשך ארבע שעות בארבע מעלות צלזיוס לפני החלפתם במאגר המתאים. שניים בלילה בארבע מעלות צלזיוס. השתמש ברכזי ספין כדי לרכז את החלבונים שעברו דיאליזה לפחות מחמישה מיליליטר ולטהר עוד יותר באמצעות כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל אם תרצה על ידי אטין שמונה.

על פי פרוטוקול הטקסט במהלך ביטוי הבדיקה, NGF ו-SE 3 A הושרו לראשונה במשך ארבע שעות ב-37 מעלות צלזיוס וניתוח עמוד SDS קבע ששני החלבונים ממוקמים בחלק מסיס זה. ביטוי החלבון נראה הוגן ולכן נבדק ביטוי בדיקה נוסף עם אינדוקציה לילית ב-18 מעלות צלזיוס. ביטוי NGF השתפר בחלק המסיס, בעוד שלא היה הבדל ניכר עם SEMA שלוש.

NGF בודד בתנאים מקוריים ולא מקוריים ורץ דרך עמודת FPLC לטיהור. למרות ש-NGF היה בחלק המסיס במהלך ביטוי הבדיקה, בידוד מקומי הניב תשואה נמוכה הן באינדוקציות של 37 מעלות צלזיוס והן ב-18 מעלות צלזיוס. עם זאת, תשואה גבוהה יותר של NGF הושגה באמצעות בידוד לא מקומי עם רטורציה מחדש.

כתוצאה מכך, NGF בודד בתנאים לא ילידיים. לאחר אינדוקציה לילית ב-18 מעלות צלזיוס, בידוד לא מקומי הביא לייצור SEMA 3 a עם 8.61 פלוס או מינוס 3.1 מיליגרם לתרבית עיקרית של שני ליטר לבידוד מקומי. לכן, SEMA 3 A הושרה במשך ארבע שעות ב-37 מעלות צלזיוס ובודד באמצעות פרמטרי בידוד מקוריים.

נאספו שיאי FPLC ודגימות NGF ו-SEMA שלוש A נותחו עם דף SDS. שיאי חלבון נוספים שנמצאו בפלט FPLC עבור SEMA 3 A נאספו ונותחו עם דף SDS ולא נמצאו באזור המשקל המולקולרי SEMA 3 A. שברים אלה הם ככל הנראה תוצרי פירוק מכיוון שהם לא התנהגו באופן פונקציונלי במבחנים מבוססי תאים, כפי שעשו שלושת SEMA.

שיא שצוין כאן. לאחר התבססות ושליטה בחלבון רקומביננטי, בידוד וטיהור אמורים להימשך מספר ימים בלבד אם הם מבוצעים כראוי. עם זאת, טרנספורמציה ראשונית של חיידקים ושלבי ביטוי בדיקה נמשכים זמן רב יותר על מנת לזהות כראוי את מסיסות החלבון.

לאחר קביעת המסיסות, ניתן לאחסן ספרייה של החיידקים שעברו טרנספורמציה במינוס 80. בנוסף, לאחר ביטוי החלבון, ניתן לאחסן כדורי אי קולי גם במינוס 80 עד לבידוד וניסויים נוספים. כאשר מנסים הליך זה, חשוב לוודא שהבופרים מעוקרים ונעשים טריים על מנת למנוע מפרוטאזות לפרק את החלבונים שלך.

יש ליצור חוצצי בידוד ולעקר כל ארבעה עד שישה שבועות, ויש להכין חוצצי דיאליזה יום לפני הבידוד. עמודות N-I-N-T-A ו-FPLC צריכות להיות נקיות על פי פרוטוקולי היצרן על מנת למנוע זיהום צולב ממספר חלבונים ביוטיניליים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לבטא, לבודד ולטהר חלבונים ביוטיניליים שתוכננו בהתאמה אישית באמצעות מערכת ביטוי מארח חיידקים.

זה דומה למה שנעשה הן מבחינה מדעית והן מבחינה מסחרית בקנה מידה קטן וגדול. לפיכך, יש לכך יישום רחב.