פרוטוקול לניתוח שכפול נגיף הצהבת מסוג C

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לחקור שלבים שונים במחזור השכפול של נגיף ההפטיטיס C. מטרה זו מושגת תחילה על ידי ייצור תמלילי RNA גנומיים של HCV מ constructs של פלסמידי HCV לינאריים. השלב השני הוא טרנספקציה של התאים ב-H-C-V-R-N-A. לאחר מכן, התאים נזרעים עבור נקודות זמן ובדיקות שונות. השלב הסופי הוא איסוף העל-נוזל (supernatant) של תרבית התאים למדידת הטרה הויראלית וקצירת התאים שעברו טרנספקציה לצורך ניתוח חלבונים ו-RNA. לבסוף, מבוצעים RT-PCR, Western blotting, בדיקת אימונופלואורסנציה ומדידת טרה של HCV, אשר מדגימים מערכת תרבית תאים זיהומית חזקה של HCV.

היתרון המרכזי של מערכת תרבית תאים זו למדבקי נגיף הפטיטיס C לעומת מערכת הרפליקון של HCV הוא שניתן לחקור את שלבי הכניסה של הנגיף, הרכבת הוויריון והיציאה שלו. פרוטוקול זה יכול לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הווירולוגיה של הפטיטיס C, כגון מורפוגנזה של ויריונים ואינטראקציה בין מאחס לפתוגן. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות עד לפיתוח חיסונים, שכן היא מאפשרת אפיון של זני נגיפים מוחלשים שניתן להעמידם כמועמדים פוטנציאליים לחיסון.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי נגיף הדלקת הכבד הנגיפית C, ניתן להחיל אותה גם על נגיפי RNA אחרים ממשפחת ה-Flaviviridae. באופן כללי, אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו יעמדו בפני האתגר של הפקת RNA גנומי של HCV באיכות גבוהה. חקר מחזור השכפול המלא של HCV הפך לאפשרי בתרביות תאים בעקבות גילוי בידוד אחד של נגיף HCV מסוג genotype-2A שגרם לדלקת כבד ברקית יפנית. הדגמה חזותית של הבדיקה הווירולוגית היא קריטית, מכיוון שהבדיקה דורשת מומחיות הן בטכניקות מולקולריות והן בטכניקות תאיות.

בשימוש בנגיף כימרי 2A תוך-גנוטיפי, F-N-X-H-C-V ונגיף HCV pol-null מסוג F-N-X-H-C-V לצורך הערכת ש replication ויראלית, linearized פלסמידים ויראליים שהופקו בעבר באמצעות עיכול עם האנזים המגביל XBA-one בשפרוֹר של 2 mL. לאחר מכן, טפלו את הפלסמידים ב-mung bean nuclease כדי ליצור קצוות קהים (blunt ends).

טהרו את הפלסמידים שעברו עיכול באמצעות כרומטוגרפיית חילוף אניונים. ודאו את שלמות הפלסמיד הליניארי על ידי הרצת ה-DNA באלקטרופורזה של ג'ל אגרוזה. לאחר מכן, הוסיפו את תבנית ה-DNA של הפלסמיד הליניארי למבחנה בנפח 0.2 מיליליטר המכילה רכיבים לתגובת T-seven RNA polymerase כדי לסנתז תמלילי RNA גנומיים של HCV.

טהרו את ה-RNA שסונתז לאחרונה ועובד ב-DNase באמצעות ערכה לטיהור RNA. לאחר מכן, ודאו את ייצור ה-RNA באמצעות אלקטרופורזה בג'ל אגרוז. לאחר מכן, קבעו את כמות ה-RNA באמצעות ספקטרופוטומטריה.

נתקו תאים דבקים מבוססי Huh-7 באמצעות טיפול באנזים טריפסין ואספו את התאים לשפופרת קונית של 50 מיליליטר. לאחר שני סבבים של סנטריפוגציה, השעיקו מחדש את משקע התאים במצע עם ריכוז סרום נמוך קר. לאחר חזרה על הסנטריפוגציה, השעיקו את התאים במצע עם ריכוז סרום נמוך בריכוז של 1 × 10⁷ תאים למילליליטר.

בשלב הבא, ערבבו סה"כ 10 µg של RNA ויראלי שתעתק עם 400 µL של תאים שעברו השהיה (resuspended) בתוך קיווטה לאלקטרופורציה בנפח 0.4 cm שהקרירה מראש. הכניסו את ה-RNA הוויראלי לתאים באמצעות אלקטרופורציה במתח של 270 V, התנגדות של 100 Ω וקיבול של 950 µF. בסיום הפעולה, השהו מחדש את התאים שעברו אלקטרופורציה ב-10 mL של מצע גידול מלא עם 15% FBS. בנקודה זו, זרעו את התאים גם בבקבוקי T 25 בריכוז של כ-1.2 × 10⁶ תאים לבקבוק וגם בלוחות 48 בארות בריכוז של 1 × 10⁴ תאים לבערה, עבור נקודות זמן של 4, 48 ו-96 שעות. החליפו את המצע 4 עד 8 שעות לאחר הטרנספקציה במצע גידול טרי עם תוספות ו-10% FBS, כדי להסיר שיירי תאים מתים מהבקבוקים ומהלוחות שבהם גודלו התאים.

בעזרת פיפט סרולוגית, אספו את העל-נוזלים (supernatants) של תרבית התאים בנקודות הזמן של 48 ו-96 שעות אל תוך מבחנה קונית של 15 milliliter. לאחר מכן, הסירו את השאריות התאיות מהדגימות שנאספו באמצעות סרכז (centrifugation) במהירות של 15,000 rpm למשך 10 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות Celsius. לאחר הסרכז, אחסנו את העל-נוזלים נטולי התאים בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות Celsius.

בצע ליזה של התאים לצורך אנליזת חלבונים ו-RNA באמצעות western blot ו-reverse transcriptase quantitative PCR או RT-qPCR בנקודות הזמן המצוינות. בצע שעתוק הפוך למיקרוגרם אחד של RNA תאי כולל באמצעות אנזים reverse transcriptase ופריימר ספציפי לגדיל ה-sense של HCV הנקשר לאזור ה-five prime untranslated region בתוך מבחנה של 0.2 מיליליטר. כמו כן, בצע שעתוק הפוך של F-N-X-H-C-V-R-N-A עם מספר עותקים גנומי ידוע באמצעות פריימר לגדיל ה-sense של HCV. באמצעות מערכת real-time PCR, בצע qPCR תוך שימוש ב-50 ננוגרמים מה-CDNA המשועתק שהתקבל, באמצעות פריימרים ספציפיים ל-HCV ותערובת qPCR super mix המכילה צבע DNA binding green. השתמש בתנאים הבאים בעת הרצת ה-qPCR כדי לקבוע את מספר העותקים של H-C-V-R-N-A. לאחר ה-qPCR, הפר את ליזת התאים מה-viral RNA שהועבר (transfected) ב-96 שעות לאחר הטרנספקציה באמצעות SDS page. לאחר מכן, העבר את החלבונים המופרדים בג'ל לממברנת polyvinylidene difluoride בשיטת trans-blot turbo. חסום את הממברנה באמצעות תמיסת חסימה המכילה 5% skim milk ו-0.2% tween-20 ב-PBS והנח אותה בתוך מכל.

דגרו את הממברנה עם נוגדן ראשוני מונוקלונלי של עכבר NS3 בדילול של 1:1,000 ועם beta-actin בדילול של 1:5,000 בחדר קירור של 4 °C. לאחר הדגירה, הוסיפו נוגדן עז נגד אימונוגלובולין-G של עכבר המצומד ל-horse-radish peroxidase בדילול של 1:5,000 ובצעו דטקציה באמצעות כימילומינסנציה.

בשלב זה, קבעו את התאים שעברו טרנספקציה של H-C-V-R-N-A באמצעות מתנול למשך 30 דקות בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס לצורך בדיקת אימונופלואורסצנציה. בסיום, שטפו את התאים עם PBS שלוש פעמים. לאחר חסימה באמצעות תמיסת חסימה לבדיקת אימונופלואורסצנציה, השתמשו בנוגדן ראשוני rabbit polyclonal anti-NS5A ובנוגדן mouse monoclonal anti-DSRNA antibody J2 בדילול של 1:200, והדגירו למשך חמש שעות עד לילה בחדר קירור של 4 מעלות צלזיוס. לאחר ההדגרה, שטפו את התאים עם PBS שלוש פעמים לאחר הטיפול בנוגדן הראשוני. לאחר מכן, הוסיפו נוגדן משני goat anti-rabbit immunoglobulin-G 488 polyclonal ונוגדן משני goat anti-mouse immunoglobulin 594 polyclonal בדילול של 1:1000, והדגירו למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר על מכשיר ניעור (rocker). לאחר שטיפת התאים עם PBS שלוש פעמים, צבעו את הגרעינים באמצעות צבע Hoechst ובחנו אותם תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

בשלב הבא, זרע תאי Huh7.5.1 נאיביים בריכוז של כ-3×10³ תאים לבאר בתוך פלטת 96 בארות. למחרת, בצע דילול סדרתי של פי 10 של עליון תרבית נטול תאים שנקצר מתאים שעברו טרנספקציה של H-C-V-R-N-A באמצעות מצע גידול, והזרק בשלוש חזרות על תאי Huh7.5.1. קבע את התאים 72 שעות לאחר ההדבקה באמצעות מתנול למשך 30 דקות בטמפרטורה של 20°-C. לאחר הוצאת התאים מהמקפיא, בצע צביעה אימונו-כימית לחלבון H-C-V NS5A לפי התנאים שתוארו קודם לכן. באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, ספור את מוקדי התאים החיוביים ל-NS5A בבאר עם הדילול הוויראלי הגבוה ביותר, וחשב את המספר הממוצע של יחידות יוצרות מוקדים (focus forming units) למיליליטר.

איכות הפלסמיד של ה-HCV הליניארי הוערכה באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל. ה-H-C-V-D-N-A הועבר לתמלול in vitro בתיווך T-seven RNA polymerase, אשר הניב תוצר RNA בודד בגודל 9.6 Kilobases. תוצאות RT-qPCR הצביעו על כך שהווירוס מסוג הבר (wild type) שכפל את הגנום ביעילות. סוג הבר הפגין רמה של שכפול גנומי הגבוהה ב-one to three log בהשוואה לווירוס pol-null.

הנגיף מסוג הפרא (wild type) ייצר את חלבון ה-NS3 המעורב בשחלוף חלבונים נגיפיים ובשכפול הגנום. נגיף מסוג הפרא ביטא גם את חלבון ה-NS5A, וחלבון ה-NS5A ו-RNA דו-גדילי נמצאו באותו מיקום (co-localized) בציטופלזמה התאית של תאים שעברו טרנספקציה של נגיף מסוג הפרא, דבר המצביע על שכפול נגיפי פעיל. מדידות של titer נגיפי העידו כי נגיף מסוג הפרא הוא זיהומי ומייצר מעל 10,000 יחידות יוצרות מוקדים (foci forming units) למיליליטר של חלקיק זיהומי. שש שעות לאחר הטרנספקציה, הן לנגיף מסוג הפרא והן לנגיף ה-pol-null הייתה פעילות לוסיפראז דומה, דבר המצביע על כך שרמה דומה של RNA שעבר טרנספקציה תורגמה. עם זאת, 48 ו-96 שעות לאחר הטרנספקציה, נגיף מסוג הפרא הראה רמות שכפול גנום מוגברות בהשוואה לנגיף pol-null. נגיף מסוג הפרא ייצר גם את חלבון ה-NS3 הנגיפי. לנגיף ה-pol-null הייתה פעילות לוסיפראז ברמת בסיס, בעוד שלנגיף מסוג הפרא הייתה רמת שכפול הגבוהה ב-2 עד 3 סדרי גודל (log) בהשוואה לנגיף הדווח (reporter virus) מסוג pol-null. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע בדיקות וירו-לוגיות של Hepatitis-C תוך שבועיים, אם הן מבוצעות כה properly. בעת ניסיון לבצע הליך זה, חשוב להשתמש בתאים חסונים ובתשארי RNA גנומיים של HCV באיכות גבוהה. בעקבות הליך זה, ניתן לבחון זני HCV מאופיינים במערכות מודל של בעלי חיים כדי לחקור כשירות in vivo ואינטראקציות בין מאח ופתוגן.

פיתוחו של מערכת תרבית תאים מזוהמת ב-HCV סלל את הדרך עבור חוקרים לחקור את שלבי המורפוגנזה של הויריון ואת שלבי היציאה של הנגיף (egress) במחזור השכפול של ה-HCV. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכישו הבנה טובה לגבי ביצוע בדיקות וירולוגיות שונות לאפיון שלבים שונים של מחזור השכפול של נגיף Hepatitis-C. זכרו כי עבודה עם נגיף Hepatitis-C עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי בטיחות, כגון לבישת ציוד מיגון אישי מתאים, בעת ביצוע פרוצדורה זו.