שימוש בתג אתר איגוד α-bungarotoxin ללמוד GABA קולטן ממברנה לוקליזציה וסחר

המטרה הכוללת של הליך זה היא למדוד לוקליזציה ואנדוציטוזיס של פני השטח של קולטן gabaa בנוירונים בהיפוקמפוס. זה מושג על ידי מעבר תאי עצב בהיפוקמפוס עם תת-היחידה המתויגת של קולטן ה-gabaa ומתן אפשרות לתאי העצב המתורבתים להתפתח באינקובטור. השלב השני הוא לתייג קולטני גבא על פני השטח עם בונגלו אלפא טואין בשילוב אלקסה פלואורסצנטית.

לאחר מכן, הנוירונים מודגרים לנקודות זמן שונות על מנת לאפשר לקולטנים מסומנים להיות אנדוציטוז. השלב האחרון הוא לתקן את הדגימות בנקודות הזמן המתאימות ולבצע צביעה חיסונית באמצעות אנטי GFP כדי לצפות במאגר הקולטנים המתויג הכולל. בסופו של דבר, מיקרוסקופיה קונפוקלית משמשת להצגת שינויים בלוקליזציה של פני השטח ובאנדוציטוזיס של קולטני ה-gabaa המתויגים באמצעות גישות הדמיה קבועות או חיות.

שיטה זו יכולה לעזור לנו לענות על שאלות מפתח בתחום הסחר בקולטנים, כגון איזו השפעה יכולה להיות לקשירת ליגנד על אנדוציטוזיס קולטנים ושיעורי החדרה, והאם ליגנדים ומודולטורים שונים יכולים להשפיע על מיחזור קולטנים ופירוקם. למרות ששיטה זו שימשה לחקר תעלות יונים קשורות קולטנים מצומדים לחלבון G בעיקר בהקשר של מערכת העצבים, ניתן ליישם אותה גם כדי לחקור את הלוקליזציה הדינמית והסחר של חלבוני ממברנה אחרים בתרבית תאים ותאים ראשוניים של רקמות מגוונות. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו משתי סיבות.

ראשית, ליצור מבנים פונקציונליים ושנית תרגול והתנסויות הדרושים לעיבוד מספר נקודות זמן בו זמנית. כדי להתחיל, הכינו ארבע עד חמש החלקות כיסוי זכוכית עגולות מצופות פולי דה ליזין בתוך כל צלחת תרבית רקמות בגודל 3.5 סנטימטר כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן טרנספקט נוירונים טריים מנותקים ביום התרבות עם אחד עד ארבעה מיקרוגרם של צלחת DNA מוכנה מקסי.

הנוירונים המועברים על הכיסוי המצופה פולי דה ליצין מחליקים בצפיפות סופית של כ-200,000 נוירונים לצלחת של 3.5 סנטימטר. החלף את המדיום ארבע עד 24 שעות לאחר הכנת תרביות עצביות. לאחר מכן אפשר לנוירונים להתפתח בחממה עד 14 עד 17 יום במבחנה או השלב הרצוי לביצוע בדיקת האנדוציטוזיס.

תחילה הגדר מכשיר חימום קירור ספסל ל -16 מעלות צלזיוס. יש לקרר ערימות חוץ-תאיות, מי מלח או HBS ל-16 מעלות צלזיוס באמבט מים. מעבירים את כלי הנוירונים לצלחת האלומיניום בחום של 16 מעלות צלזיוס ומצננים חמש דקות.

הסר את המדיום והחלף במיליליטר אחד של 16 מעלות צלזיוס HBS בתוספת 150 מיקרומולר שני בו ריין למשך שתי דקות. לאחר מכן, הסר את המדיום למיכל פסולת מסומן והחלף אותו במיליליטר אחד של 16 מעלות צלזיוס HBS בתוספת שני בו קרין פלוס רעלן אלפא בונגלו. Alexa 5 9 4 דגירה בטמפרטורה של 16 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.

לאחר הדגירה, העבירו את המדיום למיכל פסולת מסומן ושטפו את הכלים שלוש פעמים עם שני מיליליטר של 16 מעלות צלזיוס HBS לניסויים בסדרות זמן של הדמיה חיה בעקבות אנדוציטוזיס קולטן באמצעות צלחת תרבית עם תחתית זכוכית של 3.5 סנטימטר. העבירו את הצלחת לבמה מחוממת במיקרוסקופ והתחילו לצלם במיקרוסקופ קונפוקלי או דשא. הגדר להחלקות כיסוי קבועות.

העברה T שווה לאפס נקודת זמן מכסה מחליק לתוך צלחת בטמפרטורת החדר 4% פרה פורמלדהיד, 4% סוכרוז למשך 20 דקות לנקודות זמן אחרות. החלף את HBS במדיום מאוזן של 37 מעלות צלזיוס, וחזור לאינקובטור לאנדוציטוזיס ב-37 מעלות צלזיוס בנקודות הזמן הדרושות. קח כלים מהחממה ושטוף במהירות פעמיים עם שני מיליליטר טמפרטורת החדר, דלקוס פוספט, מלח חוצץ או DPBS.

לאחר מכן תקן את הדגימה ב-4% אלדהיד פרפורם, 4% סוכרוז למשך 20 דקות. לאחר קיבוע של 20 דקות, הסר 4% אלדהיד פרפורם, 4% סוכרוז למיכל הפסולת, ושטוף את הכלים פעמיים עם שני מיליליטר DPBS בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, דגרו את החלקות הכיסוי בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.

תמיסת בלוק אימונופלואורסצנטי המכילה 0.2% טריטון X 100 כדי לחלחל לתאי העצב ולאפשר צביעה חיסונית נגד GFP של מאגר הקולטנים התוך-תאיים ו/או תיוג של חלבונים אחרים מעניינים. לאחר מכן הסר את תמיסת הבלוק החדירה ודגר את החלקות הכיסוי בתמיסת בלוק אימונופלואורסצנטי ללא טריטון X 100 למשך 20 עד 30 דקות. בצע דגירה ראשונית של נוגדנים של החלקות כיסוי בבלוק למשך מספר שעות בטמפרטורת החדר או לילה בארבע מעלות צלזיוס לאחר הדגירה.

שטפו את החלקות הכיסוי על ידי השרייה ב-DPBS למשך חמש דקות בסך הכל שלוש כביסות. לאחר מכן דגרו את החלקות הכיסוי עם נוגדנים משניים בתמיסת בלוק למשך שעה בטמפרטורת החדר לאחר שעה. שטפו את החלקות הכיסוי שלוש פעמים עם DPBS כמו קודם.

לאחר מכן, הרכיב כל החלקת כיסוי על ידי הסרת עודפי נוזלים מהחלק האחורי של החלקת הכיסוי עם רקמת מעבדה ולאחר מכן היפוך החלקת הכיסוי על ארבעה מיקרוליטר של מדיום הרכבה על מגלשת זכוכית. בצע רכישת תמונה עם מיקרוסקופיה קונפוקלית עיוורת למצב ניסוי באמצעות צמצם מספרי שמן פי 60. 1.49 מטרת טבילה.

באמצעות אותן הגדרות רכישת תמונה, רכוש תמונות חתך Z בודד עם גוף התא העצבי ומספר תהליכים דנדריטיים במיקוד לכמת רעלן אלפא בונגלו, אות פלואורסצנטי של Alexa וצביעה חיסונית GFP לאורך 20 מיקרון של שלושה עד ארבעה דנדריטים פרוקסימליים לכל נוירון תוך שימוש באותו סף לניתוח כל נתוני האנדוציטוזיס. נתח נתונים מ-10 עד 12 תאי עצב עבור כל נקודת זמן. חזרה על הניסוי עם מספר תרביות עצביות עצמאיות.

אקסונים GABAergic יוצרים מגעים מעכבים על דנדריטים של נוירונים פירמידליים. מסופים מעכבים פרה-סינפטיים מזוהים על ידי מעביר חומצות אמינו מעכב שלפוחית המעמיס GABA וגליצין לשלפוחיות סינפטיות. קולטני GABA a מנוגדים מאוד לאתרי שחרור המוליכים העצביים הקשורים על ידי פיגום המעכב הפוסט-סינפטי גין החלבון המוצג כאן הם נוירונים אלפא שני phg F-P-B-B-S המבטאים נוירונים עם קולטני GABAA על פני השטח המסומנים ברעלן בונגלו Alexa 5 9 4 ואחריו צביעה חיסונית לאוכלוסיית הקולטנים הכוללת עם נוגדן אנטי GFP המוצג בירוק, והחלבון המעכב הפוסט-סינפטי גין או טרנספורטר חומצות אמינו מעכב שלפוחית.

כאן מוצג האנדוציטוזיס של אלפא 2 המכיל קולטן GABA A ונוירונים בהיפוקמפוס ב-15 יום במבחנה. מדידות פלואורסצנטיות של תהליכים דנדריטיים בודדים כפי שמוצג בפאנלים מנורמלות לרמת ביטוי המבנה באמצעות נוגדני GFP. השוואה סופית של נקודות זמן מכתים נעשית על ידי נורמליזציה למדידת T שווה לאפס.

כימות הפנמת קולטנים לאורך תקופה של 60 דקות משינויי אות פלואורסצנטיים לאורך זמן תואר בצורה הטובה ביותר על ידי מעריכי יחיד. גישה חלופית היא לעקוב אחר אנדוציטוזיס קולטן בתא עצב בודד על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית של הדמיה חיה. הקרינה המנוקבת והחופפת של קולטן GABA מתויג P-H-G-F-P וקולטנים המסומנים ברעלן אלפא בונגלו על פני השטח נראית בתחילת הניסוי לאורך הזמן אות הקולטן של קולטן אלפא בונגלו שכותרתו GABA A פוחת ככל שהקולטנים אנדוציטוז.

בעוד שאות ה-P-H-G-F-P נשאר גבוה עקב החדרת קולטנים חדשים, הירידה המינימלית באות P-H-G-F-P נובעת משינויים בהתפלגות הקולטן על פני התא והלבנת פוטו בעקבות הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות כמו בדיקות החדרת רעלן בבונגלו כדי לענות על שאלות נוספות כמו שיעורי החדרת קולטנים עם טיפולים שונים. טכניקה זו מאפשרת להעריך כיצד פעילות תאית, תחומי חלבון ספציפיים, אגוניסטים ומודולטורים אחרים יכולים לשנות את תחלופת הקולטנים בתאי עצב חיים, תאים ורקמות אחרות.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש ברעלן אלפא בונגלו יחד עם צבעי אלקסה בשילוב עם טכניקות אימונו-פלואורסצנטיות סטנדרטיות כדי לכמת לוקליזציה של קולטני פני השטח בנוירונים בהיפוקמפוס.