הדמיה כחכחה מערכות ביולוגיות שלמות ברמה תאית על ידי 3DISCO

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לדמות דגימות ביולוגיות שלמות עם תווית פלואורסצנטית ללא חתך היסטולוגי. זה מושג על ידי דגירה רציפה של רקמות קבועות בממיסים אורגניים עד להשגת שקיפות מלאה. כצעד שני.

הרקמות השקופות מצולמות בתלת מימד באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר. לאחר מכן, תוצאות ההדמיה מנותחות וניתן לשחזר את המבנים העצביים בחוט השדרה ובמוח הלא חתוכים בתלת מימד משלוש תמונות הדיסקו שנאספו. שיטה זו יכולה לסייע לענות על שאלות מפתח בתחום מדעי המוח בנוגע למיפוי קשרים עצביים ו-GAL בכל המוח וחוט השדרה.

ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על הטיפול בניוון עצבי מכיוון שאנו יכולים כעת לדמיין שלמות עצבית בכל מערכת העצבים. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי ארגון מערכת העצבים, ניתן ליישם אותה גם על איברים אחרים כמו רקמת הריאה או הגידול. לאחר שליטה, טכניקה זו אורכת רק כמה שעות לאיברים קטנים כמו חוט השדרה או הריאה, ובערך יום או יומיים למוח.

לאחר מכן העבירו את האיברים הקבועים לתמיסת הפינוי וסגרו היטב את הבקבוקונים. מניחים את הבקבוקונים על מסובב ומכסים אותם בנייר אלומיניום, תוך ערבוב הדגימות לזמן המתאים במהירות קבועה של 30 סל"ד. לאחר מכן הסר את תמיסת הניקוי והשתמש ב-PE או פיפטה חדשים כדי לתלות את הרקמה בתמיסה הבאה.

כפי שמצוין בטבלה במהלך שלב הפינוי הסופי, שמור את הדגימות בתמיסה עד שהן הופכות שקופות לחלוטין למיקרוסקופיה מרובת פוטונים או קונפוקלית. ברגע שמושגת פינוי מלא, הרכיב את הדגימה על שקופית הדמיה למטרה זו. השתמש במלט דנטלי כדי ליצור גבול סביב הרקמה.

מלאו את הבריכה בתמיסת הפינוי הסופית רגע לפני שהמלט הדנטלי הופך נוקשה לחלוטין, ולאחר מכן הניחו מיד את הדגימה המנוקה באמצע הבריכה וכסו אותה בזכוכית כיסוי. לחץ על זכוכית הכיסוי עד שהיא אטומה לחלוטין על ידי המלט הדנטלי ונוגעת במשטח האיבר המנוקה למיקרוסקופ גיליון קל ברגע שמושגת פינוי מלא, הרכב, ולאחר מכן סובב ידנית את הבורג של מחזיק הדגימה כדי לתקן את הדגימה. לאחר מכן, טבלו את הדגימה בתא ההדמיה של מיקרוסקופ גיליון האור המלא בתמיסת הפינוי הסופית המתאימה לרקמה המצולמת.

לאחר מכן אסוף סריקות Z המכסות את כל הרקמות הנקיות ברזולוציה הטובה ביותר שהמיקרוסקופ יכול לספק, תוך התמקדות באזורי העניין כדי לאסוף תמונות ברזולוציה גבוהה יותר. לאחר איסוף התמונות, טען את סדרת התמונות בתוכנת Amira עם מודול resolve RT. לאחר טעינת הסדרה, הזן את גדלי הווקסל הנכונים בחלון פרמטר קריאת התמונה ולחץ על אישור.

לאחר מכן, בחר את יישום המשנה של תצוגה רב-מישורית. לאחר מכן השתמשו במחוונים ראשוניים ובמחווני עובי לבחירת עובי ההקרנה והסף האופטימליים לערכי האפור. לבסוף, השתמש במודול פינת החיתוך כדי לעיין בפרוסות בכיווני תלת-ממד שונים.

כדי להמחיש את הדגימות, מיפוי הארגון המבני של נוירונים חשוב ביותר להבנת האופן שבו הם מתפקדים בבריאות ובמחלות. בעוד שניתן להשתמש בשלושה דיסקו על איברים שונים, הוא שימושי במיוחד למעקב אחר קשרים עצביים ארוכים בחוט השדרה ובמוח. לדוגמה, באמצעות סריקות אולטרה מיקרוסקופיות של מקטעי חוט שדרה גדולים מנוקים, ניתן לעקוב אחר הקשרים האקסונליים לאורך סנטימטרים בחוט השדרה של המכרסם כפי שמודגם בתמונות אלה.

באופן דומה, ניתן לדמות את כל מוח העכבר וההיפוקמפוס הנקי כדי לעקוב אחר קשרים עצביים במוח. כאשר משתמשים במיקרוסקופיה קונפוקלית או רב-פוטונית, ניתן לשפר משמעותית את רזולוציית ההדמיה, במיוחד בממד Z. לדוגמה, הדמיה מרובת פוטונים של חוטי שדרה מנוקים מעכברי קו GFPM משיגה תמונה חלקה לאורך כל העומק של 1.5 עד שני מילימטר של חוט השדרה.

מיקרוסקופיה קונפוקלית על חוט השדרה הנקי מספקת רזולוציה משופרת באופן דומה. הדמיית מיקרוסקופיה מרובת פוטונים של מוחות מנוקים מספקת תמונות ברזולוציה גבוהה מאוד כדי להמחיש פרטים עדינים של מבנים עצביים, כולל קוצים דנדריטיים. ניתן לתייג את הדוגמאות לשלושה דיסקו בדרכים שונות.

לדוגמה, ניתן לתייג את כל כלי הדם של המוח וחוט השדרה באמצעות עוקבים פלואורסצנטיים מצומדים של לקטין, שניתן להשתמש בהם כדי לחקור את מחסום הדם במוח בבריאות ובחולי. באמצעות שלושה דיסקו ניתן גם לדמות תאים קטנים יותר ברקמות גדולות. לדוגמה, גם מיקרוגליה וגם אסטרוציטים מעורבים מאוד בפתולוגיה של ניוון עצבי, כולל מחלת אלצהיימר ופציעות טראומטיות.

באמצעות שלושה דיסקו ניתן ללמוד את צפיפותם ותפוצתם בחוט השדרה. ניתן גם לדמות רקמות שאינן עצביות. לדוגמה, תאי קלרה בכל ריאות המכרסמים יכולים להיות מסומנים חיסונית עם נוגדנים ולצלם אותם ללא חתך ברמת תא בודד.

באופן דומה, ניתן לנקות ולדמות תאים ברקמת הלבלב הלא מאושרת. לדוגמה, תאי האלפא המסומנים פלואורסצנטית מצולמים לאחר ניקוי בתמונות הלבלב הללו. הדגמה חזותית של שיטה זו חשובה מכיוון שבעוד ששלבי הניקוי וההדמיה פשוטים, ניתוח הנתונים יכול להיות מסובך.

בעת יישום הליך זה, חשוב לדמות רקמות שקופות ברגע שתושג השקיפות המלאה מכיוון שהאות הפלואורסצנטי יתכלה עם הזמן בתמיסת הפינוי. פיתוח הטכניקה הזו סלל את הדרך לחוקרים לחקור פרטים ואיברים שלמים, כמו למשל מיפוי רשתות עצביות במוח. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לנקות ולצלם מבנים תאיים ותת-תאיים בכל האיברים, ולאחר מכן לדמיין ולנתח אותם.