נוקלאוזידים triphosphates - מ - סינתזה ביוכימיה באפיון

המטרה הכוללת של סרטון זה היא להדגים את ההליך מסינתזה של פוספטים נוקלאוזידים ששונו ועד לאפיון הביוכימי המלא שלהם. זה מושג על ידי המרה ראשונה של מבשר הנוקלאוזיד המוגן כראוי לטרי פוספט המתאים על ידי יישום הליך סיר אחד בן ארבעה שלבים. השלב השני הוא לטהר את הטרי פוספט המתקבל תחילה על ידי משקעים ולאחר מכן על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים בשלב הפוך.

לאחר מכן, האנלוגי התלת-פוספט מאופיין בתהודה מגנטית גרעינית ובסיוע מטריצה לייזר יינון זמן טיסה או NMR ומלוף כדי להבטיח טוהר גבוה. השלב האחרון הוא תגובות הארכת פריימר ותגובות פילמור דאוקסי נוקלאוטיד טרנספראז או TDT. בסופו של דבר, תוצרי התגובה, ובכך קבלת המצע של הטרי פוספט מנותחים על ידי אלקטרופורזה של ג'ל.

היתרון בשיטה זו בהשוואה לאסטרטגיות סינתטיות אחרות כמו גישת בורגה, הוא שנוצרים פחות תוצרי לוואי, ולכן הטיהור קל יותר. בדרך כלל, אנשים חדשים בטכניקה זו יתקשו מכיוון שמדובר בהליך ארוך ומורכב למדי הדורש ידע במספר תחומים. הרעיון לשיטה זו היה לצלם לראשונה כאשר סינתזנו פוספטים מהונדסים ומצאנו שזה די מאתגר למצוא הליך מפורט.

יתרון נוסף של שיטה זו הוא שניתן להשתמש בה כדי להתמודד עם שאלות אחרות בתחום חומצות הגרעין ששונו. ואכן, ניתן להשתמש בו כדי לבחור אנזימי DNA המזרזים מגוון רחב של תגובות. בנוסף, ניתן להשתמש בשיטה זו לתיוג פונקציונלי של חומצות גרעין.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד שלבי סינתזה וטיהור מכיוון שטרי פוספטים הם נגזרות קוטביות ומופעלות שיש לטפל בהן בזהירות. כדי להתחיל, יש לאדות את הנוקלאוזיד המוגן על ידי שלושה ראשונים פעמיים עם שני מיליליטר של פורין נטול מים לפני ייבוש בוואקום למשך הלילה. במקביל, אמוניום פירופוספט יבש בוואקום למשך הלילה למחרת המיס את הנוקלאוזיד במינימום של 200 מיקרוליטר של פירידין יבש.

לאחר מכן הוסף 400 מיקרוליטר דיאוקסאן יבש כממס COS. לבסוף, הוסף את נגזרת הזרחן המחזורית שלוש ואפשר לה להגיב בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות. לאחר מכן, הכינו תמיסה של בוטיל אמוניום פירופוספט יבש ב -170 מיקרוליטר דימתילפורממיד יבש ו -58 מיקרוליטר טרי בוטיל אמין מזוקק

הוסף את התמיסה המתקבלת לתערובת התגובה ואפשר לה להגיב בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות. לאחר מכן הכינו תמיסה של 160 יוד מיקרו-מולרי ב -980 מיקרוליטר פורין ו -20 מיקרוליטר מים. הוסף את התמיסה לתערובת התגובה.

על מנת לחמצן את מרכז האלפא זרחן. אפשר לתמיסה הכהה המתקבלת לערבב בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. השתמש בתמיסה מימית של 10% של נתרן תיו סולפט כדי להרוות את עודפי היוד.

הסר את הממס בוואקום. לאחר מכן מוסיפים חמישה מיליליטר מים ומניחים לתערובת לעמוד בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות כדי להידרוליזה של מוטי התלת-פוספט המחזורי. בשלב זה, קבוצות ההגנה מוסרות בדרך כלל.

כתוצאה מכך, הוסף 30% אימודיום הידרוקסיד לדגימה הגולמית. מערבבים 1.5 שעות בטמפרטורת החדר לפני שמוציאים את הממס בוואקום. לאחר מכן, הוסיפו שני מיליליטר מים וחלקו את התערובת לצינורות צינור.

הוסף 12 מיליליטר של תמיסה של 2% נתרן לכלוראט באצטון ובצנטריפוגה למשך 30 דקות לפני שתחזור על ההליך. עוד פעם. הריאגנטים המשמשים בסינתזה מהטרי פוספט יזרזו יצירת שאריות שמנוניות ויאפשרו הפרדת הממיסים, ובכך יפשטו את טיהור ה-HPLC בשלב ההפוך באופן משמעותי לאחר ייבוש אוויר של השאריות השומניות.

רשום ספקטרום תמ"ג P 31 של הדגימה הגולמית על פי נהלים סטנדרטיים. לאחר NMR המיס את שאריות השומן בארבעה מיליליטר מים מזוקקים. התחל בטיהור HPLC עם הכנת 50 מילי-מולרית טריאתיל אמוניום ביקרבונט במים טהורים במיוחד כ-EENT A וב-50% אצטיל ניטריל כ-EENT B כמפורט בפרוטוקול הטקסט, Degas הן EENT בוואקום והן תוך ערבוב במשך 20 דקות.

הכן דגימה אנליטית על ידי המסת 10 מיקרוליטר של הטרי פוספט הגולמי ב-300 מיקרוליטר מים מזוקקים. לאחר מכן שימוש בשיפוע שנע בין 0%B ל-100%B תוך 40 דקות. הזרקו את הדגימה למערכת HPLC המצוידת בעמודת שלב C 18 הפוכה למחצה.

התאם את תוכנית HPLC בהתאם לזמן השמירה של הטרי פוספט והדיפוספט. טהר את התערובת הגולמית בתנאים אלה ועל ידי הסרת שברים מוקדמים שעלולים להכיל מעט דיפוספט, שלב את כל השברים המכילים את המוצר והקפיא יבש. לאחר מכן התאדה מספר פעמים עם מים טהורים במיוחד.

להעריך את טוהר הטרי-פוספט על ידי תמ"ג ומלוף על ידי יישום פרוטוקולים סטנדרטיים. התשואות האופייניות המתקבלות על ידי יישום פרוטוקול זה נעות בטווח של 30 עד 70% בהתאם למצע לחמישה ראשוניים ותיוג הפריימר. מערבבים את הפריימר והריאגנטים כמפורט בפרוטוקול הטקסט ומדגרים את תגובת התיוג ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.

במהלך תגובת התיוג, הכינו עמודת cidex G 10 על ידי חיבור קצה פיפטה של מיליליטר אחד עם צמר זכוכית מבודד ומילוי הקצה בתמיסת G 10. יש לסובב ולשטוף שלוש פעמים עם 500 מיקרוליטר מים מזוקקים כפולים ושטיפה אחרונה אחת עם 50 מיקרוליטר מים מזוקקים כפולים. לאחר הדגירה של תגובת התיוג, החום מנטרל את הקינאז למשך 10 דקות בטמפרטורה של 70 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, העבירו את תערובת התגובה דרך ה-G 10. כדי להסיר את ג'ל התווית הרדיואקטיבי החופשי, יש לטהר את הפריימר המסומן ברדיו ולהתאושש על ידי יישום שיטת הריסוק וההשרייה, אתנול משקע ו- G 10 ממליח את האוליגונוקלאוטיד החמקמק. לתגובת הארכת הפריימר, שלב שומה אחת של PICA של פריימר עם תווית רדיו, P אחד 10 שומות PICA של פריימר, P אחד ו-10 שומות PICA של תבנית, T אחד ב-10 x מאגר תגובה וכרע ברך במים חמים.

לאחר מכן מצננים בהדרגה לטמפרטורת החדר במשך 45 דקות. הניחו את הצינור על קרח והוסיפו את הפוספט הנוקלאוזיד או קוקטייל ה-DNTP ויחידה אחת של קרח ה-DNA פולימראז. השלם את התגובה במים בנפח כולל של 20 מיקרוליטר דגירה בטמפרטורת העבודה האופטימלית של האנזים.

לאחר מכן מוסיפים 20 מיקרוליטר של תמיסת עצירה ומחממים את הדגימות בחום של 95 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. מגניב, הדגימות יורדות באפס מעלות צלזיוס. לפני הפתרון על ידי דנטורציה של אלקטרופורזה של ג'ל פולי אקרילאמיד.

דמיין את הלהקות על ידי הדמיית פוספו לפילמור TDT, לדלל פריימר חד-גדילי ללא תווית P שניים ופריימר עם תווית רדיו במיקרוליטר אחד של מאגר TDT. שים את הצינור על קרח והוסף את קוקטייל ה-DNTP ואת ה-TDT פולימראז ואז דגר ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה. לאחר הדגירה, הוסף 10 מיקרוליטר מתמיסת העצירה לפני חימום הדגימות ב-95 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות, ולאחר מכן התקרר באפס מעלות צלזיוס.

לאחר פתרון הדגימה על ידי דנטורזה של אלקטרופורזה של ג'ל פולי אקרילאמיד, דמיין את הרצועות באמצעות הדמיית פוספו. מוצג כאן ספקטרום P 31 NMR גולמי טיפוסי של DNTP שונה שבו ניתן לצפות באותות האופייניים של מרכזי הזרחן. בנוסף, אותות הנובעים מהצד הדיפוספט והמונופוספט.

מוצרים יחד עם פוספטים גבוהים יותר נצפים תמיד בשלב זה. ניתוח HPLC שלב הפוך של התערובת הגולמית מוצג כאן. השיא העיקרי מתאים לחמשת הפוספטים הראשוניים, בעוד שתוצר הלוואי העיקרי, חמשת הפוספטים הראשוניים מציג זמן שמירה מעט נמוך יותר.

לבסוף, לאחר שלב הפוך יסודי, טיהור HPLC, ה-DNTP השונה מאופיין ב-NMR ומלדי שמוצג כאן הוא ספקטרום ה-maloff של הסולפה ide, אנלוגי DUTP שונה. ניתן לראות את תוספת הנתרן בטעינת יתר של מסה של 712.54, ואין זכר לדיפוספט. גם ה-P 31 NMR וגם ספקטרום ה-NMR של הפרוטונים חיוניים להערכת הטוהר של ה-dps ששונה.

מכיוון שנוכחותם של צבע לא רצוי ומונו פוספטים נותנת אותות ייחודיים המומחשים, הנה התוצאה של תגובות הרחבה ראשוניות עם DUTP שונה DUTP שונה ו-DCTP שונה בחומצה ולרית המשמשים כשינויים בודדים כשילובים של שני DN dps ששונו או יחד, יחד עם DGTP טבעי בודד. לבסוף, תגובות פילמור מייצגות בתיווך TDT עם אנלוגים שונים של DUTP ששונו נותחו עם אלקטרופורזה של ג'ל פולי אקרילאמיד דנטור. בהקשר זה, DUTP מותאם לפרולין cis ו-DUTP ששונה בפפטיד הם המצעים הטובים ביותר ל-TDT.

מכיוון שיעילות הזנב דומה או עולה על זו של ה-DTTP הטבעי במקום זאת, DUTP שונה באוריאה הוא מצע גרוע למדי בהקשר זה. מכיוון שמעט פיזור פולי, ניתן לצפות באוליגונוקלאוטידים בגודל ארוך יותר לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך כשבוע אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור כי פוספטים ציטריים גרעיניים הם אבני הבניין המופעלות של הטבע, ולכן יש לנקוט בזהירות בעת הטיפול בהם לאחר יצירתם.

חוקרים בתחום חומצות הגרעין משתמשים בשיטה זו כדי לחקור בחירות קומבינטוריות ליצירת אברים וחומצות גרעין קטליטיות שונה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לסנתז ולאפיין פוספטים ששונו באמצעות הליך פופ ארבעת השלבים הראשון, ואחריו טיהור HPLC שלב הפוך ותגובות הארכה ראשוניות. כמה פרטי ניסוי שאינם נמצאים בדרך כלל בקטעי ניסוי יתגלו.

ניתן להשתמש בשיטה זו בשילוב עם טכניקות אחרות כגון PCR כדי לענות על שאלות נוספות. ואכן, ניתן להשתמש בו כדי להעריך את התאימות של טרי פוספטים ששונו לשיטות של בחירת VIO.