בידוד של קטן noncoding RNAs מסרום האדם
19 ביוני 2014
פרוטוקול זה מתאר שיטה להפקת RNA קטן מסרום אדם. אנחנו השתמשנו בשיטה זו כדי לבודד מיקרו RNA בסרום מהסרטן לשימוש במערכי ה-DNA וגם PCR כמו singleplex. הפרוטוקול מנצל ריאגנטים פנול וthiocyanate guanidinium עם שינויים להניב RNA באיכות גבוהה.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד RNA באיכות גבוהה מדגימות סרום. באמצעות הגרסה האופטימלית שלנו של פרוטוקול MRC הנפוץ נסה מגיב RTLS. זה מושג על ידי דילול הסרום ביחס של אחד לחמש עם מים נטולי נוקלאז כדי להפחית את זיהום החלבון.
השלב השני הוא הכנסת שני צינורות נעילת פאזה של מיליליטר לשלב הצנטריפוגה הראשון. זה לוכד את רוב המזהמים, כגון פנול וחלבונים בשלב האורגני. לאחר מכן, שלב האופטימיזציה השלישי והאחרון הוא סיבוב צנטריפוגת הבזק ב-12,000 גבינה, אשר מסיר כל זיהום שיורי מכדור ה-RNA לפני שטיפת האתנול.
השלב האחרון הוא לאגד שני תכשירי RNA מותאמים מאותו מטופל אם נדרשת תפוקת RNA כוללת גבוהה יותר. בסופו של דבר, על ידי שימוש בשיטה שונה זו, אשר מסיסים סרום במים נטולי נוקלאז, משתמש בצינור נעילת פאזה כדי ללכוד מזהמים עיקריים ומציג ספין הבזק. אנו מראים כי ניתן למקסם את ההתאוששות של RNA קטנים שאינם מצופים מבידוד RNA מסרום.
היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו פרוטוקול בידוד RNA טריול סטנדרטי, הוא שבאמצעות שינויים פשוטים, אנו יכולים למקסם את תפוקת ה-RNA מהסרום. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון ש-RNA קטנים נמצאים בכמויות נמוכות בסרום. השיטה האופטימלית וההדמיה של שלבים אלה ישפרו את ההתאוששות של RNA אלה וידריכו טירונים לטיפ בידוד מוצלח.
כדי להתחיל להפשיר את דגימת הסרום הקפואה שהוכנה קודם לכן על קרח, ולאחר מכן להעביר 400 מיקרוליטר מהסרום הטרי שהופשר לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה מסומן. לאחר מכן, יש לדלל את הסרום ב -100 מיקרוליטר מים ללא R nase ולהוסיף 50 מיקרוליטר של פרוטאינאז K בריכוז של מיליגרם אחד למיליליטר. לאחר מכן דגרו את הסרום המדולל ב-37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות כדי לאפשר עיכול חלבון נאות כדי להבטיח מסיסות מלאה ב-1.5 מיליליטר של טרי-ריאגנט RTLS ו-100 מיקרוליטר של ארבעה אנול פרומו.
הפוך לזמן קצר את ההומוגנאט ובצע פיפטינג חוזר ונשנה למשך חמש שניות. לאחר מכן העבירו את התערובת לצינור נעילת פאזה כבד של שני מיליליטר. סובב את ההומוגנאט ב-12,000 GS למשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, שפכו בזהירות מיליליטר אחד מהתמיסה המימית המתקבלת לתוך צינור קשירה נמוך DNA טרי. יש ללכוד את האורגני והממשק מתחת לג'ל הלבן של צינור נעילת הפאזה. לאחר מכן הוסף לתמיסה המימית חמישה מיקרוליטר גליקוגן ו -500 מיקרוליטר של 100% איזופרופנול.
מערבבים את התמיסה בהיפוך ודוגרים אותה למשך הלילה במינוס 20 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה הלילית, צנטריפוגה את הדגימה למשך 20 דקות ב-12,000 GS בצנטריפוגה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, השליכו את הסופרנטנט השקוף ובצעו סיבוב הבזק במשך שתי דקות ב-16,000 GS בצנטריפוגה של ארבע מעלות צלזיוס.
בעזרת פיפטה, הסר בזהירות את התמיסה השקופה המקיפה את הגלולה. לאחר מכן שטפו את הגלולה עם מיליליטר אחד של אתנול 70% וצנטריפוגה את הדגימה ב-10,000 GS למשך 10 דקות. כדי לדמיין את הגלולה, הטה את הצינור מול רקע כהה והסר את תמיסת הכביסה.
חזור על הכביסה. התקדמו. אנו משעים את הגלולה ב -10 מיקרוליטר מים ללא RNA.
ודא שהגלולה מומסת לחלוטין על ידי חימום הדגימה ב-55 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. במהלך תקופה זו, ערבבו את הדגימה עם פיפטינג חוזר ונשנה לקבלת מאגר תפוקת RNA כולל גבוה יותר, שני תכשירי RNA מאותו מטופל. כמת את ה-RNA המושעה באמצעות UV לעומת
ספקטרופוטומטר והעריך את איכות ה-RNA באמצעות ביו-אנלייזר 2100. לאחר מכן אחסן את דגימות ה-RNA המאוגדות במינוס 80 מעלות צלזיוס לשימוש ביישומים במורד הזרם. פרופילים פוטומטריים של ספקטרום של RNA מסרום אנושי מדגימים את התשואה המשופרת של RNA עקב הוספת מספר שלבים לגישת צ'אם חומסקי המסורתית.
פרופיל UV טיפוסי של RNA מבודד מסרום אנושי מנוגד לאלה המשתמשים בשלבי אופטימיזציה, כולל הוספת גליקוגן וספין נוסף, וכל אחד מהכלים הללו ביחד הביא להפחתת מזהמים ולהגדלת תפוקת ה-RNA הכוללת. טוהר דגימת ה-RNA הוגדל עוד יותר עם שימוש בג'ל נעילת פאזה, הלוכד פנול וחלבונים. בנוסף, להגדלת נפח הסרום יש השפעה ניכרת על תפוקת ה-RNA.
בוצע מעקב ביו-אנלייזר כדי לנתח עוד יותר את איכות הדגימה. ספייק בודד בכ-21 נוקלאוטידים מייצג את פרופיל מערך שבר המיקרו RNA ו-QPCR בוצעו בעקבות ההליך. פרופיל מערך זה של שלושה סרטני ראש וצוואר ו-S תקין אחד מראה ביטוי של מיקרו-RNAs, מנותח באמצעות אשכולות היררכיים ומוצג כמפת חום שבה ניתן לראות ויסות מעלה והפחתת ויסות של המיקרו-RNAs.
עקומות הגברה QPCR הבאות נוצרו עבור מיקרו-רנ"א ספציפיים. לאחר מכן נעשה שימוש בנתונים אלה כדי לשרטט ערכי CT גולמיים עבור הסרום הרגיל לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו על פני כל מספר חולים המייצרים RNA באיכות גבוהה במקסימום של היום אם היא מבוצעת כראוי לאחר ההליך. ניתן לבצע שיטות אחרות כמו PCR כמותי או ריצוף מהדור הבא על מנת לענות על שאלות נוספות כמו גילוי ואימות סמנים ביולוגיים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר שיטה למיצוי של RNA קטן באיכות גבוהה מדגימות סרום אנושי. ההליך שעבר אופטימיזציה נועד לבידוד של microRNA עבור יישומים כגון מערכי DNA ו-PCR כמותי.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה
- מיצוי RNA
רקע
- ל-Small RNAs תפקיד מכריע בבקרת ביטוי גנים.
- בידוד RNA באיכות גבוהה חיוני ליישומים מדויקים בהמשך התהליך.
- דגימות סרום עלולות להוות אתגר בשל זיהום בחלבונים.
- פרוטוקולים מותאמים נחוצים כדי לשפר את תפוקת ה-RNA ואת טוהר הדגימה.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה מהימנה למיצוי RNA קטן מסרום.
- שיפור איכות ה-RNA עבור יישומים מחקריים.
- אספקת פרוטוקול הממזער זיהומים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- דילול הסרום במים נטולי נוקלאס להפחתת זיהום חלבונים.
- שימוש במבחנות בעלות מחסום פאזה (phase lock tubes) במהלך סבב צנטריפוגה להפרדת מזהמים.
- צנטריפוגה מהירה (Flash centrifugation) להסרת שאריות זיהום ממשקעי ה-RNA.
- שטיפות אתנול לטיהור ה-RNA.
תוצאות עיקריות
- הפרוטוקול מבודד בהצלחה RNA קטן באיכות גבוהה.
- זיהום מינימלי מוביל לשמירה טובה יותר על שלמות ה-RNA.
- ניתן להשתמש ביעילות ב-microRNAs המבודדים במגוון בדיקות.
- הוכחה ישימות במחקרים על סרטן.
מסקנות
- שיטה זו מספקת גישה חסונה לחילוץ RNA מסרום.
- RNA באיכות גבוהה חיוני לקבלת תוצאות ניסוי אמינות.
- ניתן להתאים את הפרוטוקול לצרכי מחקר שונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בידוד של RNA קטן שאינו מקודד באיכות גבוהה מסרום אנושי מאפשר גילוי של סמנים ביולוגיים ותיקוף של מטרות באונקולוגיה ובתחומי מחלה אחרים. השיטה נותנת מענה לאתגר של תנובת RNA נמוכה וזיהומים בסרום, ובכך משפרת את הביטחון החיזוי במערכי בדיקה של סמנים ביולוגיים בשלבים מוקדמים. באמצעות שימוש בנפח דגימה מינימלי ובריאגנטים סטנדרטיים של מעבדה, הפרוטוקול תומך בתהליכי עבודה ניתנים לשכפול ולהרחבה עבור מסלולי מחקר טרנסלציונליים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקה של דפוסי ביטוי של microRNA כסמנים ביולוגיים פוטנציאליים או כמטרות טיפוליות במסלולי מחלה.
- ערך תפעולי: מספק שיטה מהימנה להשגת כמות RNA מספקת מנפחי סרום מוגבלים לצורך תיקוף תפקודי בהמשך.
סינון ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: מפיק RNA בדרגת טוהר גבוהה המתאימה ליישומים של microarray ו-qPCR, מה שמבטיח זיהוי מדויק של שינויים בביטוי של RNA קטן.
- ערך תפעולי: מפחית שונות הנגרמת ממזהמים כגון פנול וחלבונים, ובכך משפר את השחזוריות של הבדיקה בין הרצות שונות ובמעבדות שונות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: תומך בהמשכיות מגילוי סמנים ביולוגיים בסרום ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות מודלים רלוונטיים למחלה.
- ערך תפעולי: מאפשר קבלת החלטות מותאמת סיכונים על ידי אספקת נתוני RNA כמותיים ובאיכות גבוהה לצורך תיעדוף מטרות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי המוקדם, ותומכת בזיהוי מטרות המונחה-השערה ובפיתוח בדיקות לפני אופטימיזציה של מובילים.
- ביולוגיה של גילוי: מקל על בדיקת היפותזות על ידי מתן אפשרות לשחזור של small RNAs בריכוז נמוך מסרום לצורך פרופיל ביטוי.
- סריקה: מייצר תכלילי RNA סטנדרטיים המשפרים את השחזור והרגישות בפלטפורמות סריקה מבוססות microarray ו-qPCR.
- אנליטיקה: מייצר תנובת RNA כמותית ומדדי איכות (למשל, ספקטרום UV, עקבות bioanalyzer) המאפשרים השוואה אובייקטיבית של שלמות הדגימה ומעורבות המטרה.
- מחקר תרגומי: מקשר בין ממצאים של ביומרקרים מבוססי סרום למחקרי מנגנון על ידי אספקת RNA המתאים לבדיקות תפקודיות במערכות מודל.
- שימוש חוזר ארגוני: עושה שימוש בריאגנטים ובציוד זמינים באופן נרחב, מה שמאפשר התאמה בין צוותים ואתרים שונים ללא צורך בתשתיות מיוחדות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בתיקוף המטרה על ידי הפחתת אותות שגויים הנובעים מפירוק RNA או מזיהום.
- ערך תפעולי: משפר את התפוקה והעקביות באמצעות שלבים מפושטים, כגון שימוש ב-phase lock gel וצנטריפוגה מהירה (flash centrifugation).
- ערך אסטרטגי: תומך בהחלטות go/no-go בתוכניות של ביומרקרים על ידי אספקת נתונים אמינים מסוגי דגימות נגישים קלינית.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר זיהוי מוקדם יותר של מטרות בעלות פוטנציאל גבוה, ובכך מפחית את ההשקעה במועמדים בעלי רמת ביטחון נמוכה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בסיסית בביולוגיה מולקולרית בטיפול ב-RNA ובטכניקות צנטריפוגציה.
- תלוי בציוד מעבדה סטנדרטי, כולל מיקרו-צנטריפוגות, מבחנות phase lock וספקטרופוטומטרים.
- מחייב נהלי עבודה סטנדרטיים כדי להבטיח עקביות בשלבי הדילול, האינקובציה והשטיפה בין המשתמשים השונים.
- עשוי לדרוש אופטימיזציה בעת התאמה לנוזלי גוף או לסוגי רקמות אחרים, בשל פרופילים משתנים של מזהמים.
- מוגבל בשל הריכוז הנמוך המובנה של total RNA בסרום, דבר המחייב איסוף דגימות משולב (pooling) במקרים של תנובה נמוכה.
