שתי שיטות לקביעת אדם תאי רירית הרחם סטרומה ראשיים מדוגמאות כריתת הרחם

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבסס תרביות תאי סטרומה ראשוניות של רירית הרחם מכריתת רחם שנכרתה. זה מושג על ידי הבחנה והפרדה של שכבות הרחם כדי לבודד קטע מרקמת רירית הרחם. השלב השני הוא בחירת טכניקת בידוד תאים בין שיטות הגירוד והניסיון בעת שימוש בשיטת הגירוד.

כוח מכני וגירוד משמשים להפרדה ולניתוק תאי סטרומה של רירית הרחם. לחלופין, כאשר משתמשים בשיטת הטריפסין, הפעילות האנזימטית של טריפסין משמשת להפרדה ולניתוק של תאי סטרומה של רירית הרחם. בסופו של דבר, מיקרוסקופיה משמשת לצפייה בצמיחה ומורפולוגיה של תאים, בעוד שטכניקות אחרות שנדונו בכתב היד משמשות לאימות תרביות סטרומה של רירית הרחם.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות פיזיולוגיות מרכזיות בתחום הרבייה, תופעות כגון מחזור הרבייה והווסת: דגימות כריתת רחם המשמשות בכתב יד זה נאספו בהתאמה עם פרוטוקול אתיקה מאושר של האוניברסיטה IRB שמספרו I-R-B-H-S-R מספר 1 4 4 2 4. שמור רקמה שמקורה במטופל בשפופרת של 50 מיליליטר המכילה RPMI או DMEM עם גלוקוז גבוה בארבע מעלות צלזיוס למשך לא יותר מ-24 שעות לפני עיבוד הדגימה. כשמוכנים להתחיל, שטפו את דגימת הרקמה שלוש פעמים עם XPBS אחד והשליכו את התמיסה בין כל שטיפה.

לאחר מכן הוסף לדגימת הרקמה ארבעה עד 10 מיליליטר של מצע גדילה בתוספת 10% FBS ו-1% סטרפטומיצין פניצילין. כמו כן, הוסיפו אזור פטריות לריכוז סופי של 0.25 מיקרוגרם למיליליטר ודגרו למשך 30 דקות. לאחר מכן, השליכו את אמצעי הגידול ושטפו את הרקמה פעמיים עם XPBS אחד.

הנח את הרקמה על צלחת תרבית תאים של שישה סנטימטרים וזהה את שכבת רירית הרחם באמצעות תמונות אלה כמדריך. לאחר מכן הפרד את רירית הרחם ושמור את שכבות הרקמה האחרות לשימוש עתידי. השתמש באזמל או סכין גילוח כדי להעביר את הרקמה לחתיכות קטנות תוך כדי גירוד על צלחת תרבית התאים.

השריטות מקלות על ההצמדה של תאי הסטרומה הראשוניים של רירית הרחם המתהווים. לאחר מכן, הוסף בעדינות שני מיליליטר של מצע גידול לכלי השרוט. בשלב זה, שברי רקמות יהיו גלויים ומשותקים מתנועת הגירוד.

מניחים את המנה בחממת תרבית תאים ייעודית בנפרד מקווי תאים אחרים כדי למנוע זיהום. עקוב אחר התאים מדי יום באמצעות מיקרוסקופ אור. חפשו אוכלוסיות קטנות של תאים שיוצאים מהרקמה החתוכה ביום השני או השלישי כל שלושה ימים.

הסר בעדינות את תרביות שטיפת המדיה הישנות עם XPBS אחד ולאחר מכן הוסף שני מיליליטר של מדיית גידול טרייה. התחל להוסיף ארבעה מיליליטר של מצעי גידול. ברגע שקצב ההתפשטות עולה במהלך שלבי הכביסה יש לשאוב את פיסות הרקמה הנותרות.

סביר להניח שמושבות חדשות לא יצמחו מהרקמה. לאחר שבוע של מעבר גדילה, התאים משתמשים ב-0.05% טריפסין. כאשר התאים מגיעים בין 75 ל-80% שטף אז הקפיאו צלחת אחת של תאים.

ברגע ששתיים או שלוש לוחות נשמרים, לא ניתן להעביר תאים ראשוניים ללא הגבלת זמן. כדי להתחיל בבידוד בתיווך טריפסין, הניחו חתיכה קטנה של רקמת רירית הרחם בצינור חרוטי עם שני מיליליטר של 0.25% טריפסין בתוספת 0.03 מיליגרם למיליליטר. לאחר מכן יכול מיצין לדגור את הרקמה על פלטפורמה מסתובבת ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.

לאחר מכן, מערבל לזמן קצר את הרקמה ולאחר מכן צנטריפוגה בטמפרטורה של 200 עד 400 פעמים G למשך שתי דקות, השליך את הסופרנטנט והוסף טריפסין טרי. ואז יכול מיצין לדגור על הרקמה ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת תוך כדי סיבוב. לאחר הדגירה, מערבל את הרקמה למשך חמש עד 10 שניות.

לאחר מכן הוסף שני מיליליטר של מצע גידול המכיל 10% FBS ו-1% סטרפטומיצין פניצילין. כדי לנטרל את הטריפסין, צנטריפוגה את התאים בעוצמה של 200 עד 400 פעמים G למשך שתיים-שלוש דקות. לאחר מכן השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את כדור התא.

בשני מיליליטר של צלחת אמצעי גידול מתרחף התא על צלחת תרבית תאים של שישה סנטימטרים ומגרד את הצלחת כדי לשפר את ההתקשרות של התאים הראשוניים. עקוב אחר צמיחת התאים מדי יום במיקרוסקופ אור והחלף את מצע הגידול כל יומיים-שלושה. לאחר שהתאים הגיעו לשטף של 75 עד 80%, השתמש ב-0.05% או 0.25% טריפסין כדי לעבור אותם, תוך בידוד תאי סטרומה של רירית הרחם.

שימוש בשיטת הגירוד מייצר אשכולות של תאים מתעוררים מוקדמים. לאורך השריטות הנגרמות על ידי אזמל, ניתן לזהות את תאי הסטרומה של רירית הרחם על ידי מורפולוגיה פיברובלסטים שלהם. לשיטת הטריפסין זמן הכנה ארוך יותר משיטת הגירוד, אך תאים ברי קיימא נצפים מוקדם יותר.

שיטת ה-tryin מייצרת גם תאים עם דפוסי גידול מקובצים ומפוזרים כאחד. טרם התגלה סמן ספציפי לרקמה לתאי סטרומה של רירית הרחם. אחת הדרכים לזהות תאי סטרומה של רירית הרחם היא על ידי מדידת אובדן סמן.

לתאי אפיתל כגון ציטוקרטין. מחסור בציטוקרטין מדגים היעדר תאי אפיתל של רירית הרחם. אובדן צביעת הציטוקרטין שנצפה במעבר החמישי בהשוואה למעבר השני, מאשר את היעדרם של תאי אפיתל.

ניתן לספק ראיות פונקציונליות לנוכחות תאי סטרומה של רירית הרחם באמצעות בדיקת דה-סלולריזציה. העלייה בחלבון קושר פרולקטין וגורם גדילה דמוי אינסולין בתגובה לטיפול ב-CAMP והידרוקסי פרוגסטרון אצטט מצביעה על ביסוס מוצלח של תרבית סטרומלית של רירית הרחם. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להקים תרביות תאי סטרומה ראשוניות של רירית הרחם מכריתת רחם שנכרתה.