בידוד של אדם מונוציטים ידי זוגי Gradient צנטריפוגה והבידול שלהם להמקרופאגים בתיקי תרבית תאים מצופים טפלון

המטרה הכוללת של הליך זה היא לייצר מקרופאגים אנושיים בכמות ובאיכות גבוהה עם ציוד מעבדה סטנדרטי. זה מושג על ידי צנטריפוגה ראשונה של דם ממעילי באפי בשיפוע קריאת FI כדי לאסוף את ה-P BMCs cs. לאחר מכן, בשיפוע לכל קריאה, המונוציטים מופרדים מהלימפוציטים.

לאחר מכן המונוציטים נזרעים בשקיות תרבית תאים מצופות טפלון ומובחנים. לאחר שישה או שבעה ימים, מקרופאגים נקצרים ונזרעים למחקרים הבאים. התאים המתקבלים צריכים לבטא את הסמנים האופייניים למקרופאגים בוגרים ולהגיב לגירויים שונים כגון גידול משותף עם תאי גידול או גירוי עם LPS, היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כגון זרימה נגדית, צנטריפוגה או מיון תאים מופעלים מגנטיים, הוא שניתן ליצור מקרופאגים אנושיים עם ציוד שפתיים סטנדרטי ללא צורך בריאגנטים או מכשירים יקרים.

בעוד ששיטה זו קלה לביצוע, אנשים חדשים בשיטה זו עשויים להתקשות בהדמיה ובהפרדה של אוכלוסיות התאים השונות בשיפועי הצפיפות. לכן, הדגמה חזותית של שלבים אלה תעזור להתגבר על קשיים אלה. פרוטוקול זה מבוצע בשכפול כדי להקל על איזון הרוטורים.

התחל בחיטוי שתי שקיות של שבר הפרווה של באפי משכבות דם. לאחר מכן העבירו את מעילי באפי לשני צינורות של 50 מיליליטר לכל מעיל של באפי. הכן שלושה צינורות של 50 מיליליטר עם 15 מיליליטר של תמיסת קריאת FI בטמפרטורת החדר במחיר של 1.077 גרם למיליליטר.

עכשיו לאט ובזהירות, שכבו 30 עד 35 מיליליטר של פרווה נפוחה על כל שפופרת של שיחת FI. השכבות לא צריכות לערבב צנטריפוגה צינורות אלה מבלי להישבר ב -400 גרם למשך חצי שעה. בטמפרטורת החדר בין שני השלבים, תיווצר טבעת לבנה של תאים חד-גרעיניים בדם היקפי.

הסר את השכבות הללו בעזרת פיפטה מפלסטיק. שלב את שכבות שלושת הצינורות מכל תורם לשתי צינורות של 50 מיליליטר לכל תורם. שטפו את התאים שנאספו על ידי הוספת מילי-מולרית אחת P-B-S-E-D-T-A עד לקו ה-40 מיליליטר, ולאחר מכן צנטריפוגה אותם ב-300 גרם למשך 10 דקות מבלי להישבר בטמפרטורת החדר.

עכשיו שאפו והשליכו את הסופרנטנטים. לאחר מכן חזור על הכביסה ו-P-B-S-C-D-T-A השעיה מחדש ואגד את הכדורים מכל תורם ו-20 מיליליטר של RPMI בתוספת FCS ללא פנול אדום. כעת צריך להיות צינור אחד של תאים לכל תורם.

כעת הכינו את תערובת השיפוע בצפיפות שנייה של 23.13 מיליליטר טמפרטורת החדר לכל תמיסת שיחה עם 1.87 מיליליטר של 10 XPBS בצינור של 50 מיליליטר. הכן צינור אחד של התערובת לכל שתי דגימות. לאחר מכן, העבירו 23 מיליליטר מהתערובת לצינור חדש של 50 מיליליטר.

לאחר מכן הוסף 27 מיליליטר RPMI בתוספת FCS עם פנול אדום. התוצאה היא פתרון אוסמוטי ISO של 46% לכל שיחה. כעת עבור כל העברת תורם, 25 מיליליטר מתמיסה של 46% לצינור של 50 מיליליטר ושכבה בזהירות על תערובת התאים.

יש להבחין בין שני השלבים לפי צבעיהם ללא הפסקה. צנטריפוגה של התאים למשך חצי שעה בטמפרטורת החדר וב-550 גרם.טבעת לבנה של מונוציטים תצטבר בין שני הפנים. אוספים את התאים הללו לצינור של 50 מיליליטר עם פיפטה מפלסטיק.

שוטפים את המונוציטים עם מילי-מולארי אחד P-B-S-E-D-T-A, מלא עד לסימן 50 מיליליטר. לאחר מכן צנטריפוגה אותם ב -400 גרם מבלי להישבר במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את המונוציטים הגלולים ב -20 מיליליטר בינוני. לאחר מכן המשך לסעיף הבא.

פרוטוקול זה משתמש בשקיות תרבית מצופות טפלון FEP כתא תרבית. התחל בהערכת מספר המונוציטים שנאספו. מונוציטים גדולים ולעתים קרובות בעלי צורה לא סדירה.

אל תספור את הלימפוציטים הקטנים יותר. אם קיימים 100 עד 150 מיליון תאים של תורם אחד, הכינו 180 מיליליטר של RPMI משלים. אם יש פחות תאים, הכינו נפחי 30 מיליליטר של מדיום לכל 30 עד 50 מיליון תאים.

במנה של 20 מיליליטר, מערבבים בזהירות את התאים לתוך 180 מיליליטר של מדיום מוכן. לאחר מכן טען את שקית התרבות עם התאים עם מזרק פרפו של 50 מיליליטר המחובר לתקע בשקית התרבות. הסר את המזרק, דחף החוצה את האוויר שנותר וכסה את התקע בקונוס.

כעת דגרו על השקיות למשך שישה עד שבעה ימים עם 5% פחמן דו חמצני. לאחר שישה עד שבעה ימים של דגירה, העבירו את שקיות התרבית לקרח כדי לקצור את התאים, טבלו את השקיות לחלוטין בקרח ואפשרו להן להתקרר במשך שעה עד שלוש שעות כדי לנתק את התאים. לאחר מכן, משוך בעדינות את השקיות מעל קצה כ -10 פעמים.

לאחר מכן יש לחטא היטב את החלק החיצוני של השקיות. החלף את חרוט התקע במזרק של 50 מיליליטר. לאחר מכן משוך את מתלה התאים והעביר אותו לצינור של 50 מיליליטר.

כאשר כל הצינורות נאספים, סובבו אותם ב-400 גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, כעת שאפו את הסופרנטנט ואגד את כל התאים ל-10 מיליליטר של RPMI בתוספת FCS. לאחר מכן ספור את התאים כמו קודם. ספירת המקרופאגים רק כשאריות לימפוציטים עשויות להימצא.

לאחר מכן השתמש בתאים ליישום עניין לשימוש חוזר בשקיות התרבית. שטפו אותם פעמיים עם אתנול 70%. לאחר מכן מלאו אותם ב -50 מיליליטר אתנול 70% ודגרו אותם למשך הלילה בטמפרטורת החדר למחרת, שטפו את השקיות שלוש פעמים עם PBS סטרילי.

ואז עטפו אותם בנייר עיקור וחיטוי אותם. ניתן בקלות לעשות שימוש חוזר בשקית פי 10 משיפוע הצפיפות. צנטריפוגות מניבות ממשק לבן המכיל לימפוציטים ומונוציטים.

כאן אנו בוחנים את שיפוע הדחיסות הראשון. מאי גרונוולד. צביעה של תאים אלה מראה גם יחס ציטופלזמה גבוה של גרעין, האופייני ללימפוציטים וגם גרעינים בצורת שעועית או טבעת, האופייניים למונוציטים.

כתמים אלה מראים את תוצאות השיפוע השני. כל פרווה של באפי מניבה כ-150 מיליון מונוציטים, אותם ניתן להבדיל לכ-70 מיליון מקרופאגים. ב-20 תכשירים, 47% מהמונוציטים הפכו למקרופאגים.

ניתן להעשיר עוד יותר את המקרופאגים המטוהרים על ידי היצמדות למשטחי פלסטיק, תכונה שאינה משותפת לתאים המזהמים. לאחר הציפוי, רוב המקרופאגים מראים מורפולוגיה של ביצה מטוגנת בעוד שלאחרים יש ציר מתוח דמוי פנוטיפ. התאים מאופיינים בביטוי של מספר סמנים.

אופייני למקרופאגים בוגרים. ביטוי של CD 11 B טוען כנגד התמיינות דנדריטית, כמו גם היעדר ביטוי CD 2 0 9. לאחר ההתמיינות, התאים נשארים פעילים מבחינה תפקודית ומטבולית במשך חמישה עד שבעה ימים.

צביעת סידן של תאים ברי קיימא מראה את יכולתם לקלוט שלפוחיות חוץ-תאיות עם תווית אדומה שנשפכות מתאי הגידול. בנוסף, ניתן להפעיל את המקרופאגים, למשל, גירוי עם ליפופוליסכריד מביא לביטוי של מספר גנים פרו-דלקתיים. בעקבות הליך זה, המקרופאגים המבודדים יכולים להיות נתונים לספקטרום עצום של בדיקות תפקודיות על מנת לענות על שאלות בסיסיות על ביולוגיה של מקרופאגים בבריאות וחולי.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לייצר מספר גבוה של מקרופאגים אנושיים. עם זאת, חשוב לזכור שאתה עובד עם דגימות דם אנושיות, שעלולות להיות מדבקות.