כימות וגודל-פרופיל של תאית שלפוחית ​​באמצעות Pulse חישה מתכוונן התנגדותי

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לכמת ולהתאים פרופיל שלפוחיות חוץ-תאיות באמצעות חישת דופק התנגדות מתכווננת. הגישה הסטנדרטית היא להשוות את מדידות החסימה הנוכחיות שנלקחו משלפוחיות חוץ-תאיות מטוהרות לאלו שנלקחו מתקני חרוזי פוליסטירן. גישה שנייה לאפיון שלפוחיות חוץ-תאיות היא להקפיץ את הדגימה בחרוזי פוליסטירן, המשמשים בעבודה עם דגימות מורכבות כגון שלפוחיות חוץ-תאיות לא מטוהרות.

במדיום תרבית תאים, הנתונים המתקבלים מאפיינים את גודל ומספר השלפוחיות החוץ-תאיות, בין אם הן מטוהרות או לא מטוהרות. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו כתמים מערביים או ציטומטריית זרימה של שלפוחיות חוץ-תאיות לשעבר הקשורות לחרוזי לטקס, הוא ששיטה זו מאפיינת חלקיקים ישירות בנוזלים ביולוגיים ללא צורך בבידוד פיזי או תיוג. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה יתקשו מכיוון שהשלפוחיות החוץ-תאיות הטרוגניות בגודלן.

כאשר מנסים לזהות את השלפוחיות הקטנות יותר, שלפוחיות גדולות יותר עלולות לסתום את הננו-נקבוביות. הוספנו כמה טיפים וטריקים מעשיים לפרוטוקול כדי לחזור במהירות לתנאים מעשיים. ניסינו להפחית את ייצור השלפוחיות החוץ-תאיות ונזקקנו לשיטה לכימות ריכוז השלפוחיות בתרבית תאים. סנאט.

בחיפוש אחר שיטות לאפיון חלקיקי ננו, נתקלנו ב-TRPS ושינינו את הפרוטוקולים שלו כך שיתאימו יותר לאפיון של חללים ותרביות תאים. S supernatants, ונוזלים ביולוגיים אחרים התחל בחיבור מכשיר ה-TRPS למחשב עם תוכנת חבילת הבקרה המותקנת עליו. הקפד למזער הפרעות חשמליות כפי שנדון בפרוטוקול הטקסט.

כעת, בחר את גודל ננופור. NP 100 הוא הבחירה הטובה ביותר עבור שלפוחיות של 70 עד 200 ננומטר, בעוד ש-NP 150 יכול לשמש עבור שלפוחיות בגודל 85 עד 300 ננומטר. NP 200 מתאים יותר למדידת שלפוחיות של 100 עד 400 ננומטר.

לאחר מכן בחר את חלקיקי כיול הפוליסטירן המשלימים עבור NP 100 ו- NP 150 בחר חלקיקי כיול CPC 100 עבור NP 200. השתמש בחלקיקי כיול CPC 200. מערבולת את חלקיקי הכיול למשך 30 שניות.

אם הם עדיין מצטברים, השתמש בסוניקציה ואז דלל את חלקיקי הכיול ב-PBS לריכוז היעד. בהתבסס על גודל הננו-נקבוביות, הנפח הסופי חייב להיות לפחות 40 מיקרוליטר. כעת הרטיבו את תא הנוזל התחתון של המכשיר על ידי מריחת 78 מיקרוליטר PBS והסרתו מיד.

זה מפחית את הסיכון להיווצרות בועות מתחת לננו-נקבוביות. לאחר מכן, הנח את הננופור בזרועות הכלי. מדוד את המרחק בין שתי הזרועות המנוגדות באמצעות מחוגה דיגיטלית.

הזן ערך זה לתוכנה תחת השדה הנקרא מתיחה ולאחר הזנתו, לחץ על כיול מתיחה באמצעות גלגל הצד השולט במרחק בין הזרועות היריבות. מתחו את הננו-נקבוביות ל-47 מילימטרים. לאחר מתיחה לגודל, יש למרוח מחדש 78 מיקרוליטר PBS על תא הנוזל התחתון.

התחל את תהליך הכיול על ידי הנחת תא הנוזל העליון על הננו-נקבוביות והצמדת כלוב המיגון. לאחר מכן הוסף 40 מיקרוליטר של חלקיקי כיול מדוללים לתא הנוזל העליון. כעת הפעל לפחות 0.8 קילופסקל של לחץ חיובי.

באמצעות מודול הלחץ המשתנה או ה-VPM, בחר מתח חיובי ולחץ על הפעל. לאחר מכן צמצם לאט את המתיחה תוך ניתוח החסימה. אירועים הנגרמים על ידי חלקיקי הכיול.

ככל שהמתיחה יורדת, גובה החסימה יגדל בהדרגה ויחס האות לרעש ישתפר. הגדלת המתח יכולה גם להגדיל את גובה החסימה, אך יכולה גם לייצר יותר רעש RMS. הפסק להפחית את המתיחה כאשר החסימות שנצפו עולות כראוי על רמות הרקע כפי שצוין מלוח מעקב האותות.

שנית, שימו לב לקצב החלקיקים. עם זאת, יש לכך חתך פחות מחמיר. קצב החלקיקים צריך להיות באופן אידיאלי לפחות 100 לדקה.

עם זאת, אם קצב החלקיקים גדול מ-2000 לדקה, יש לדלל את הדגימה ולכייל מחדש את המכשיר. קצב כה גבוה יכול להוביל למדידות לא מדויקות עבור הדגמה זו. מאופיינות שלפוחיות חוץ-תאיות מטוהרות בעבר מקו תאי גידול במוח.

התחל בהעמסת חלקיקי הכיול למכבש תאי הנוזל העליון. הפעל ואז הפעל לחץ באמצעות ה- VPM ורשום כאן לפחות 500 חלקיקי נתונים. מופעל לחץ של 0.8 קילופסקל.

לחלופין, ניתן לבצע מדידת לחץ מרובה כדי לעשות זאת, להגביר את הלחץ המופעל ולהקליט קובץ כיול שני. תוספות הלחץ חייבות להיות לפחות 0.2 קילופסקל כעת, הסר את הדגימה מהתא העליון ושטוף את התא שלוש פעמים עם 100 מיקרוליטר PBS לכל שטיפה. לאחר השטיפות, נגב את תא הנוזל העליון בנייר נטול מוך.

הוסף את הדגימה הניסיונית לאחר מכן. זרם הבסיס חייב להיות בטווח של 3% מהזרם שנצפה בעת מדידת חלקיקי הכיול. אם לא, הקש או סובב את מכסה המיגון, החל את הבוכנה או הסר לחלוטין את הננו-נקבוביות ושטוף אותה במים.

אם הזרם הנצפה טוב, הפעל בדיוק את אותם לחצים המופעלים על חלקיקי הכיול. לאחר מכן רשום לפחות 500 חלקיקים ושמור את קובץ הנתונים. אם יש הפרעה פתאומית בזיהוי חלקיקים, ירידה בזרם הבסיס או עלייה פתאומית ברעש RMS, השהה את ההקלטה ונסה לפתוח את סתימת הננו-נקבוביות.

כמו קודם, פיפטה את הדגימה למעלה ולמטה. הקש או סובב את מכסה המיגון, החל את הבוכנה או הסר לחלוטין את הננו-נקבוביות ושטוף אותה במי DI. אסטרטגיה נוספת היא להגדיל את מתיחת הננו-נקבוביות עד 47 מילימטרים ולמקסם את הלחץ מה-VPM למשך כחמש דקות.

מכיוון שזה יכול גם UNC לנתק את ה-NPO בתוכנה. עבור לכרטיסייה ניתוח נתונים והתחל לעבד את הנתונים על ידי לחיצה ימנית על אפשרות הקבצים הלא מעובדים ובחר באפשרות עיבוד קבצים. לאחר מכן, כדי לשייך את קבצי הדגימה והכיול, לחץ על תיבת הסימון לצד הדוגמה.

בעמודה המכוילת, בחר את הקבצים המתאימים ואישור. הבחירות. התוכנה תציג מאפייני מדגם שונים כמו גודל, התפלגות, משכי בסיס, רוחב מלא, חצי מקסימום וניתוח ריכוז.

הגישה הבאה משמשת לדגימות כגון נוזלים ביולוגיים המובילים לסתימת יתר בשיטה הסטנדרטית בהכנה, צנטריפוגה לפחות 50 מיקרוליטר של תרבית תאים. סופרנטנט המכיל את השלפוחיות החוץ-תאיות למשך שבע דקות ב-300 Gs.הכן גם בקרה לבד מדיה באותו אופן הן לדגימה והן לבקרה. העבירו 20 מיקרוליטר של הסופרנטנט לצינורות חדשים והוסיפו 20 מיקרוליטר של PBS ו-10 מיקרוליטר של מלאי חרוזי פוליסטירן מדולל של 335 ננומטר ב-10 מיליון חרוזים למיליליטר.

כעת הגדר את המכשיר כמו קודם, באמצעות NP 200 Nanopore ומדוד את דגימת הבקרה של חרוזים בלבד במדיה. ראשית, למען הדיוק, יש למזער את זיהוי הרקע של חלקיקים קטנים שאינם חרוזים לפחות מ-10% מזיהויי החרוזים. כעת, מדוד כל דגימה פעם אחת לפני רישום שכפולים.

זה יפיץ את תנאי הננו-נקבוביות המשתנים על פני הדגימות. יש למדוד כל דגימה שלוש פעמים בכל הגימור על ידי מדידה מחדש של דגימת חרוז הכיול בלבד. מאוחר יותר. במהלך ניתוח נתונים, השתמש בתוכנת גיליון אלקטרוני כדי לבצע חישובי ריכוז.

חישוב לדוגמה כלול בפרוטוקול הכתוב. שלפוחיות חוץ-תאיות טוהרו מתרבית תלת-תאית U 87 M-G-E-G-F-R-V, סופרנטנט על ידי אולטרה-צנטריפוגה, ולאחר מכן נמדדו באמצעות הפרוטוקול המתואר באמצעות חרוזי כיול של 115 ננומטר. התקבלה התפלגות גודל לשלפוחיות החוץ-תאיות.

שלפוחיות חוץ-תאיות כומתו גם ישירות מתרבית תאי גליובלסטומה, תוך שימוש בגישה האלטרנטיבית שמזנקת את הדגימה עם תקן. נצפו שתי אוכלוסיות ננו-חלקיקים. השלפוחיות החוץ-תאיות הקטנות יותר והתקן הידוע הגדול יותר, הערכת הגודל של שתי האוכלוסיות על סמך התקן הידוע, זיהו את אוכלוסיית השלפוחית כגדולה מ-140 ננומטר.

ייתכן ששלפוחיות חוץ-תאיות קטנות יותר זוהו באמצעות פתח ננו-נקבוביות קטן יותר, אך הייתה סתימה רבה יותר ברגע ששולטים בהן. טכניקה זו יכולה להיעשות תוך שעה עד ארבע שעות, תלוי במספר הדגימות שנותחו. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור שדגימות עשויות לדרוש התאמות מחיצה לפרוטוקול.

לדוגמה, דגימות המורכבות משלפוחיות גדולות יותר עשויות לדרוש שימוש בננו-נקבוביות גדולות יותר במתיחה גדולה יחסית, וגם ניתן להקל על מדידות על ידי סינון הצנטריפוגה שלנו של דגימות כדי להסיר פסולת תאית, שיכולה לשעון את הננו-נקבוביות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לאפיין שלפוחיות חוץ-תאיות באמצעות TRPS. בהתאם לדגימת השלפוחית החוץ-תאית שלך, אתה יכול להחיל את הפרוטוקול הסטנדרטי או להשתמש בשיטת הספייק המותאם.