מבחני ביוכימיים לניתוח פעילויות של ATP תלוי הכרומטין שיפוץ אנזימים

מטרת ההליך הבא היא למדוד את הפעילויות הביוכימיות השונות של מתחמי שיפוץ כרומטין תלויי TP. זה מושג על ידי מדידת החלקה תלויה ב-TP של נוקלאוזום מיקום מקצה אחד של מולקולת DNA למיקום מרכזי יותר ב-DNA על ידי שימוש בבדיקת הסטת ניידות אלקטרופורטית או EMSA. ניתן להשתמש בשיטה דומה מבוססת EMSA כדי לנטר את היווצרותם של אזורי מונונוקלאו קשורים מורכבים כדי להעריך את פעילות קשירת הנוקלאוזומים של מתחמי שיפוץ הכרומטין.

בנוסף, ניתן להשתמש בכרומטוגרפיה של שכבה דקה כדי למדוד את פעילות ה-APAs של מתחמי שיפוץ כרומטין תלויי TP. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בשיטות אלה כדי למדוד את שיפוץ הכרומטין התלוי ב-TP של אדם במתחמי O 80. בסרטון זה נדגים בדיקות ביוכימיות החוקרות מתחמי שיפוץ כרומטין NO 80.

ניתן ליישם שיטה דומה גם לחקר מתחמי שיפוץ כרומטין אחרים גם כדי לבצע את בדיקת שיפוץ נוקלאוזום תלוי TP. ראשית הכן מצעי נוקלאוזום לאחר הגדרת תגובת PCR של 100 מיקרוליטר כמתואר בטבלה. בצע את תגובות ה-PCR במחזור תרמי ולאחר מכן העביר את תוצרי התגובה פעמיים דרך עמודות ספין חופשיות נוקלאז כדי להסיר נוקלאוטידים לא משולבים.

לאחר מכן, מערבבים שני אולות של P 32 המסומנות 6 שברי DNA 0 1 עם שישה מיקרוגרם של נוקלאוזומים הילריים ב-50 מיקרוליטר של חיץ, ודוגרים את התערובת ב-30 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר מכן יש לדלל את התערובת ברצף ל-0.8 טוחנת, 0.6 מולרית ו-0.4 מולרית נתרן כלורי על ידי תוספת של 12.5 מיקרוליטר, 20.8 מיקרוליטר ו-41.6 מיקרוליטר בהתאמה של תמיסת חיץ tris HCL בתוספת דגירה של E-D-T-A-P-M-S-F ו-DTT למשך 30 דקות ב-30 מעלות צלזיוס לאחר כל הוספה, לאחר הדגירה האחרונה ב-125 ולאחר מכן 250 מיקרוליטר של מאגר טריס הידרוכלוריד. תוספת נוספת של P 40 גליצרול ו-PSA ללא חוב בשני דילולים נוספים, 30 דקות, 30 מעלות צלזיוס ל-0.2 מולרית ו-0.1 מולרית נתרן כלוריד בהתאמה.

לאחר מכן אחסן את המצע המונו-נוקלאוזום בארבע מעלות צלזיוס למשך עד שלושה חודשים לפני הגדרת הבדיקות יצוק ג'ל פולי אקרילאמיד מקומי. לאחר מכן, עבור כל תגובה שתבוצע, שלב כ-20 ננו-מולרי ב-oh 80 עם הכמות המתאימה של מאגר EB 100 המספיקה כדי לתת נפח של 4.75 מיקרוליטר בסיליקון מקורר מראש. צינור מיקרו צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר מקפיא מיד את כל השברים הנותרים המכילים NO 80, אבקת קרח יבש

לאחר מכן, חלקו 5.25 מיקרוליטר של קוקטייל מאסטר טרי שהוכן לכל צינור תגובה, תוך ערבוב היטב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. לאחר מכן דגרו את התגובות בגוש חום של 30 מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה מוסיפים 1.5 מיקרוליטר של תערובת הסרה טרייה לכל צינור כדי לסיים את התגובות, ואז מערבבים כל צינור תגובה.

ובכן סובבו אותם ודגרו אותם בחום של 30 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות נוספות. בינתיים, הפעל מראש את ג'ל הפולי אקרילאמיד המקורי ביחידת אלקטרופורזה אנכית ב-100 וולט למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס, תוך שימוש ב-0.5 XTBE כמאגר רץ עם מוט ערבוב מגנטי בתוך החדר התחתון כדי לשמור על זרימת חיץ קבועה בסוף הדגירה עם הסרת תערובת, ערבב 2.5 מיקרוליטר של תבנית טעינה עם כל תגובה. ולאחר סיבוב קצר, השתמש בטיפים לטעינה כדי להעמיס את הדגימות על הג'ל.

הפעל את הג'ל ב -200 וולט למשך 4.5 שעות בארבע מעלות צלזיוס עם זרימת חיץ. לאחר מכן העבירו את הג'ל לערימה של שני גיליונות נייר סינון ושחררו את מסנני הנייר עם הג'ל למעלה באמצעות ניילון שקוף כדי לזהות את האות. חשוף את הג'ל למסך פוספו אחסון בארבע מעלות צלזיוס למשך הזמן הרצוי, ולאחר מכן סרוק את המסך עם מערכת סורק הדמיית איזוטופים ונתח את הנתונים באמצעות התוכנה המתאימה לביצוע מבחני APA תלויי DNA ונוקלאוזום.

התחל בשילוב של 10 עד 50 ננו-מולר של תת-קומפלקסים מטוהרים חיסוניים עם כמות של מאגר EEB 100 המספיקה כדי לתת נפח של 2.2 מיקרוליטר בצינור מיקרו צנטריפוגה אחד מקורר מראש של 1.5 מיליליטר לכל תגובה, ולאחר מכן הקפיא מיד כל שברים המכילים NO 80 באבקת קרח יבש. לאחר מכן מערבבים בעדינות 2.8 מיקרוליטר של תת-קוקטייל טרי שהוכן המכיל נוקלאוזומי DNA או אף אחד מהם לאנזים המכיל צינורות תגובה עם פיפטינג למעלה ולמטה ומעבירים את הצינורות לגוש חום של 30 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, השתמש בעיפרון כדי לצייר קו בהיר מאוד לפחות 1.5 סנטימטרים מהקצה התחתון של פוליאתילן בגודל 20 על 10.

אני מתכוון לכרומטוגרפיה של שכבה דקה או צלחת TLC. לאחר מכן הבחין ב-0.5 מיקרוליטר מכל תערובת תגובה על הקו ב-5, 15, 30 ו-60 דקות לאחר הדגירה, והחזיר מיד כל דגימה לגוש החום, כך שניתן לקחת מספר נקודות זמן מצינור יחיד. לאחר מריחת הדגימה האחרונה, השתמש במייבש שיער לייבוש הצלחת ולאחר מכן העביר את הצלחת לתא זכוכית המכיל מספיק.

0.375 אשלגן פוספט מולארי כדי לאפשר לטבול את 0.5 הסנטימטרים התחתונים של צלחת ה-TLC בתמיסה. מכסים את החדר ומפתחים את התגובה עד שהחלק הקדמי של שלב הנוזל מגיע לחלק העליון של לוחית ה-TLC, ובשלב זה יש לייבש את הצלחת מיד ולחשוף אותה למסך פוספו אחסון בטמפרטורת החדר. לבסוף, סרוק את המסך עם מערכת סורק הדמיה איזוטופית כדי לקבוע את כמות הרדיואקטיבית של מצע TP ותוצר DP.

ניסוי ראשון זה מדגים כי קומפלקס מטוהר באמצעות דגל IES דגל שני, N-O-A-T-E ודגל NO 80 דלתא N יש פעילויות החלקה נוקלאוזומיות דומות המצביעות על כך שקצה NO 80 N ו/או יחידות המשנה הקשורות אליו ניתנים לחלוקה מחדש של נוקלאוזומים על ידי קומפלקס NO 80. לעומת זאת, קומפלקס מטוהר באמצעות דגל NO 80 דלתא n דלתא HSA אינם פעילים בבדיקה זו, מה שמצביע על כך שפעילות השיפוץ תלויה בתחום ה-HSA של NO 80 APAs ו/או יחידות המשנה הקשורות אליו. באמצעות שינוי של הליך בדיקת ההזזה של NUCLEOSOME, ניתן למדוד את פעילות קשירת הנוקלאוזום של מתחמי שיפוץ כרומטין.

בניסוי זה, הדגירה של הנוקלאוזומים עם כמויות הולכות וגדלות של קומפלקסים שלמים של NO 80 שטוהרו באמצעות תת-היחידה NO 80 E הובילה להיעלמות תלוית מינון של הרצועה המתאימה לאזורי המונוקלאו החופשיים ולהופעתו של מין חדש שנדד ליד החלק העליון של הג'ל. לעומת זאת, בעוד שהנוקלאוזומים הודגרו עם קומפלקסים קטנים יותר שטוהרו באמצעות NO 80 דלתא N וחסרה תת-קבוצה של תת-יחידות NO 80, המינים המוסטים נדדו מהר יותר, מה שמרמז על כך שהניידות היחסית של הרצועה הסופר-מוסטת נקבעת על ידי גודל בדיקת הקומפלקסים. בניסוי אחרון זה, מוצגות תוצאות של בדיקה המשווה את פעילויות ה-APA המופעלות על ידי DNA ו-NUCLEOSOME של שני תת-קומפלקסים שונים של NO 80.

הכתמים הנודדים לאט יותר תואמים לאלפא 32 P ההתחלתי המסומן TP, והמינים הנודדים מהר יותר הם תוצרי תגובת A DP עם האזורים המציינים את כיוון נדידת הממס. בעת השימוש בהליכים אלה, חשוב לזכור לבצע בדיקות המשתנות לאורך הזמן ומכילות ריכוזים שונים של אנזימים. זה יבטיח שמדידות מתבצעות כאשר זמן המוצר ועקומות תגובת המינון הן ליניאריות.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לנתח את פעילויות קשירת הנוקלאוזום של TPAs והזזת נוקלאוזום של מתחמי שיפוץ כרומטין מטוהרים. אל תשכח שעבודה עם חומרים רדיואקטיביים עלולה להיות מסוכנת. יש לנקוט באמצעי זהירות כמו לבישת חלוק מעבדה וניטור הגנה על העיניים לזיהום רדיואקטיבי וסילוק נכון של פסולת רדיואקטיבית.