Assay התנהגות פשוט לפונקציה של Visual בדיקה ב Laevis Xenopus
12 ביוני 2014
Xenopus laevis ראשנים מעדיפים שחייה בצד הלבן של טנק בשחור / לבן. התנהגות זו מונחה על ידי החזון שלהם. בהתבסס על התנהגות זו, אנו מציגים assay פשוט כדי לבדוק את תפקוד הראייה של ראשנים.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לבחון את התפקוד החזותי של ראשנים על ידי רישום משך הזמן שהחיה מבלה על מחצית ממיכל הבדיקה המכוסה בשחור. זה מושג על ידי העלאת ראשנים לשלבים 45 עד 50. השלב השני הוא להקים מיכל חצי שחור וחצי לבן יחד עם מצלמה לבדיקת ההתנהגות.
לאחר מכן, הניחו מיכל שני עם ראשן לתוך המיכל החיצוני. עבור כל רשומת ראשנים, ההתנהגות מונחית הראייה כרקע בסביבתה משתנה. השלב האחרון הוא לבצע מעשה סדום ברשתית על הראשנים ולאחר מכן לחזור על מבחן ההתנהגות.
בסופו של דבר, נתונים מהבדיקה הפשוטה והזולה הזו משמשים כדי להראות שלראשנים יש העדפה לשחות בצד אחד של המיכל על פני הצד השני, תחת בדיקות של ראיית פוטוטופ. היתרון העיקרי בשימוש בשיטה זו על פני טכניקות אחרות כמו התגובה הקינטית האופטית או בדיקת היפוך הזנב, הוא שמדובר בשיטה זולה ופשוטה המשתמשת בציוד הזמין ברוב מעבדות האופוס. כדי להכין את הראשנים, ראשית, השג עוברי קסנופוס מופרים, שים סימנים, צלצולים מותאמים או MMR מדולל בפקטור של 10 ב-60 מילימטר צלחות פטרי עם 50 מיקרוגרם למיליליטר.
אנטיביוטיקה של גנטמיצין ממקמת את בלסטולה לעוברים בשלב הצלחת העצבית. שלבים 2 עד 15 ב-18 מעלות צלזיוס בצלחות הפטרי. ברגע שהעוברים מגיעים לכוס חדשה לטובת שלב של כ-27 עד 30, החליפו אותם ל-0.1 XMMR ללא אנטיביוטיקה כדי לאפשר צמיחת חיידקי מעיים.
כאשר הראשנים מגיעים לשלב ההזנה בסביבות שלב 45, העבירו אותם לצלחות פטרי של 100 מילימטר עם 0.1 XMMR. למחרת, האכילו אותם באבקת סרפד. לאחר שבוע בצלחת פטרי 100 מילימטר, מלאו מיכל של חצי ליטר במי צפרדעים.
העבירו בעלי חיים למיכל והמשיכו בלוח הזמנים של האכלת אבקת הסרפד, אך החליפו את המים רק פעמיים עד שלוש בשבוע. כאשר בעלי החיים נמצאים במיכלי חצי ליטר, שמור אותם באור של 12 שעות, מחזור חושך של 12 שעות עם אורות נדלקים בשעה 6:00 בבוקר לפני הבדיקה, הנח את מיכל חצי ליטר עם הנבדקים על משטח לבן למשך הלילה למשך 12 שעות לפחות לפני הבדיקה. בדיקת ההתנהגות צריכה להיעשות באזור שקט ודל תנועה עם תאורת פלורסנט סטנדרטית.
הכן שני מיכלי בדיקה מקננים של חצי ליטר בפינות החיצוניות של מה שיהיה המיכל הפנימי. השתמש בשארפי כדי לסמן את קו המים בחמישה סנטימטרים מעל התחתית. גם עבור המיכל הפנימי, זהה את כל החריצים בחלק הפנימי שלו.
מלאו אותם בתרכובת אינרטית כדי למנוע ראשנים להתעכב בהם. כעת הפנה את תשומת הלב למיכל החיצוני השני. לשלב הבא, השג סרט חשמלי שחור ונייר טישו לבן.
השתמש בסרט כדי לכסות את החלק החיצוני של מחצית אחת של המיכל ובנייר הטישו כדי לכסות את החלק החיצוני של השני כפי שמוצג כאן. לאחר הכנת המיכלים, הקימו פטיפון חיסון והניחו עליו את הטנקים המקוננים. מקם חצובה ומצלמת רשת כך שהמצלמה תוכל לצלם את פנים הטנקים מלמעלה.
חבר את מצלמת האינטרנט למחשב באמצעות תוכנת לכידת וידאו והשמעה. הפעל את המצלמה והתכונן להקלטת סרט חדשה. לאחר מכן עטפו בד כותנה קל משקל מעל המצלמה והמיכלים.
כדי להפחית רמזים חיצוניים לראשנים, השתמש במד זוהר ובדוק שהבהירות מתחת לבד היא בין 35 ל-50 נרות למ"ר. התחל את בדיקת ההתנהגות על-ידי אחזור מיכל הבדיקה הפנימי. מלאו אותו במי צפרדע עד לסימן חמישה סנטימטרים.
השתמש ברשת כדי להעביר בעל חיים ממיכל חצי ליטר שלו למיכל הבדיקה הפנימי במחשב. ודא שתוכנת ההקלטה פתוחה ומקליטה את אזור הבדיקה לשמירת רשומות. כתוב את שם החיה, התאריך והשעה על פיסת נייר.
הנח את זה מתחת למצלמה להקלטה. לאחר סיום זה, הגדר מראש טיימר לשתי דקות. לאחר מכן, כוון את המיכל החיצוני על הפטיפון, כך שהצד השחור יהיה בצד ימין.
כעת הנח את מיכל הבדיקה במיכל החיצוני. באזור ההקלטה, סגור את הווילון והשתמש במסך המחשב כדי להבטיח את כיוון המיכל החיצוני. ודא שהווידאו מוקלט והפעל את הטיימר.
כאשר הטיימר מצפצף, שמור את הווילון במקומו והסר את מיכל הבדיקה הפנימי. לאחר מכן, סובב את המיכל החיצוני 180 מעלות כך שהצד השחור יהיה כעת משמאל. החזר את מיכל הבדיקה למיכל החיצוני והפעל את הטיימר של שתי הדקות.
שוב, הסר את המיכל הפנימי. סובב את המיכל החיצוני ב-180 מעלות, והחלף את המיכל הפנימי כל שתי דקות בסך הכל 10 פעמים. בסיום, הפסק את הקלטת הווידאו.
החזר את הראשן למיכל חצי ליטר שלו. הכינו מיקרוסקופ לביצוע מעשה סדום ברטינול. ממלאים צלחת פטרי בגודל 60 מילימטר ב-1% ארוס מומס ב-0.1 XMMR ונותנים לה להתמצק.
הסר חתיכה מלבנית קטנה של הארוס בגודל הראשנים. כשמוכנים להמשיך, שלפו את חיית הניסוי והניחו אותה ב-0.02%Trica. המשיכו כשהוא לא מגיב לצביטה בזנב עם מלקחיים מספר שלוש.
ואז העבירו את החיה לתבשיל. המשך על ידי הרכבת צלחת הפטרי על המיקרוסקופ. התכוננו לחזק את החיה עם מלקחיים בצד אחד.
בצד הנגדי, השתמש במחט בגודל 25 כדי לנקב את העור מאחורי האזור הגבי של העין בזווית של 45 מעלות, הושיט יד בזהירות לתוך החור עם מספר חמש, מלקחיים וחתוך את עצב הראייה תוך הימנעות מהווריד שלידו. הפוך את העצב מהדרך ומשוך את המלקחיים לאחר הניתוח. שחזר את החיה על ידי הנחתה בצלחת פטרי של 100 מילימטר עם 0.7 XMMR ו-50 מיקרוגרם למיליליטר.
גנטמיצין למשך 20 דקות. לאחר מכן, העבירו את הראשן למיכל התאוששות עם מי צפרדע. הנח את המיכל על משטח לבן לקראת הבדיקה.
תנו לבעל החיים לנוח למשך הלילה. למחרת בבוקר השתמש במבחן ההתנהגותי כדי לבדוק את תפקוד הראייה. סרט זה מציג נתונים מייצגים עבור הניסוי.
משמאל החיות לפני הניתוח, מימין אותן חיות לאחר שאקסוני הרשתית משתי העיניים נקטעו. זה מסומן על ידי הסכימה בפינות התחתונות. המים הופרעו כדי להראות שלא נוסף דבר כדי להדוף את החיות מהצד השחור או למשוך אותן לצד הלבן.
הראשנים לפני הניתוח מגיבים לצבע הרקע תוך פחות מ-30 שניות בעוד הראשנים העיוורים שוחים ללא מטרה סביב המיכל. תרשים זה מציג את אחוז הזמן שהושקע באזורים הלבנים והשחורים עבור בעל חיים בודד בשלושה תנאים. ראשית, החיה נצפתה לפני כל ניתוח באמצעות הבדיקה.
יומיים רצופים לאחר כריתת עצב הראייה הימני, נצפתה התנהגותו במשך יומיים של בדיקות. לבסוף, לאחר ששני עצבי הראייה נקטעו, היו עוד יומיים של תצפית עם הבדיקה. החיה בילתה ימים נוספים בצד הלבן של המיכל כאשר לפחות עצב ראייה אחד היה שלם.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבדוק את הראייה של ראשנים באמצעות ריאגנטים וציוד פשוטים שנמצאים ברוב מעבדות הצפרדעים. בהצלחה בניסויים שלך.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
ראשנשאי *Xenopus laevis* מראים העדפה לשחייה בצד הלבן של מיכל שחור/לבן, מה שמעיד על כך שהתנהגותם מונחית על ידי ראייה. מחקר זה מציג בדיקה פשוטה להערכת התפקוד החזותי של ראשנשאי צפרדע.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה התנהגותית
- מדע הראייה
רקע
- Xenopus laevis הוא אורגניזם מודל נפוץ בביולוגיה של ההתפתחות.
- העדפות חזותיות של ראשני קרפדה יכולות לספק תובנות לגבי היכולות החושיות שלהם.
- הבנת התפקוד החזותי היא קריטית ללימוד התנהגות בסביבות מימיות.
- ניתן להשתמש במערך בדיקה זה כדי להעריך את השפעתם של שינויים סביבתיים על התנהגות חזותית.
מטרת המחקר
- בדיקת התפקוד החזותי של ראשני *Xenopus laevis*.
- ביסוס בדיקה התנהגותית המודדת את הזמן המושקע במקטעים שונים של המיכל.
- חקירת האופן שבו רמזים חזותיים משפיעים על התנהגות ראשני הצפרדע.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- גידול השבחים לשלבים 45 עד 50 לצורך בדיקה.
- הקמת מיכל שחציו אחד שחור וחציו השני לבן עבור מבחן ההתנהגות.
- תיעוד הזמן שהשבחים שהו בכל חלק של המיכל.
- ביצוע כריתת רשתית (retinal ex sodomy) לשבחים וחזרה על המבחן.
תוצאות עיקריות
- הראשניות הראו העדפה משמעותית לצד הלבן של המיכל.
- נצפו שינויים התנהגותיים כאשר הסביבה ברקע שונתה.
- הבדיקה מדדה ביעילות את התפקוד החזותי על בסיס העדפות שחייה.
- ניתוח הרשתית סיפק תובנות לגבי היכולות החזותיות של הראשניות.
מסקנות
- ניתן להעריך ביעילות את התפקוד הוויזואלי של ראשני Xenopus laevis באמצעות בדיקה התנהגותית פשוטה זו.
- התוצאות מעידות כי לראייה תפקיד מכריע בהכוונת התנהגות השבבים.
- ניתן להחיל שיטה זו על מחקרים נוספים בנושא עיבוד תחושתי באורגניזמים מימיים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בדיקה זו מספקת שיטה בעלות נמוכה וניתנת להרחבה להערכת תפקוד חזותי במודל של חולייתנים, התומכת בתיקוף של מטרות בשלבים מוקדמים של גילוי תרופות למדעי העצבים. באמצעות כימות של התנהגות מונחית ראייה, היא מאפשרת הפחתת סיכונים מכניסטית של תרכובות המשפיעות על מסלולים תחושתיים. הגישה מציעה רציפות תרגומנית ממחקרי ראייה בסיסיים להערכה פרה-קלינית של חומרים נוירו-אקטיביים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר חקירה של תפקוד המסלול הוויזואלי באמצעות מדדים התנהגותיים מדידים.
- ערך תפעולי: משתמש בציוד זמין, ובכך מפחית את המחסומים לאימוץ במעבדות מחקר.
- ערך ניבואי: תומך בבדיקת השערות עבור תרכובות המכוונות למטרות רטינליות או למטרות עיבוד עצבי.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay Development)
- מוכנות הבדיקה: מייצר מדדי העדפה כמותיים המתאימים להתאמה לסריקה בעתקת תפוקה גבוהה (high-throughput).
- שחזוריות: הגדרה סטנדרטית של המיכל ותנאי התאורה מבטיחים תוצאות עקביות בין מפעילים שונים.
- יכולת הרחבה: תכנון של מיכלים מקוננים מאפשר בדיקה במקביל, ובכך תומך באוטומציה עתידית לסריקת תרכובות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מדמה תפקוד לקוי של הראייה הרלוונטי לניוון רשתית ולהפרעות התפתחותיות נוירולוגיות.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מבדילה בין השפעות מוטוריות כלליות לבין ליקוי ראייה ספציפי באמצעות בדיקה של הצד הנגדי.
- המשכיות תרגומית: מגשרת בין סריקה פנוטיפית לבין תיקוף תפקודי במערכת הרלוונטית למחלה.
שילוב בתוך תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
הבדיקה מתאימה לתהליכי עבודה בשלבי הגילוי המוקדמים, ובמיוחד עבור תיקוף מטרות וזיהוי מובילים (lead identification) בתוכניות נוירו-מדעיות המתמקדות בעיבוד חזותי.
- ביולוגיה של תגליות: תומכת בתיקוף תפקודי של מטרות חזותיות על ידי קישור מניפולציה גנטית או פרמקולוגית להתנהגות מדידה.
- סריקה: מספקת פלטפורמה לסריקה ראשונית או משנית של תרכובות המשפיעות על התנהגות מונחית-ראייה.
- אנליזה: מייצרת מדידות של זמן-בשטח (time-in-zone) המאפשרות השוואה סטטיסטית בין קבוצות ביקורת לקבוצות טיפול.
- מחקר תרגומי: מקשרת למודלים פרה-קליניים על ידי הערכת תוצאות תפקודיות של התערבויות רשתיות או עצביות.
- שימוש חוזר ארגוני: מהווה פלטפורמה התנהגותית הניתנת לשימוש חוזר וניתנת להתאמה לאורך מספר פרויקטים במדעי המוח.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון במעורבות המטרה על ידי הפחתת תוצאות חיוביות שגויות הנובעות מהשפעות מוטוריות לא ספציפיות.
- ערך תפעולי: עלות נמוכה ופשטות מקדמות אימוץ נרחב ללא צורך בהכשרה מיוחדת.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות לגבי המשך או הפסקת הניסוי (go/no-go) באמצעות אספקת מדדים תפקודיים מוקדמים של מסלולים חושיים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעוד סדרי עדיפויות של תרכובות מותאם סיכון, בהתבסס על ספציפיות התנהגותית.
שיקולי יישום
- דורש מיומנויות בסיסיות בגידול בעלי חיים לצורך תחזוקה וקביעת שלבי התפתחות של ראשני Xenopus.
- תלוי בציוד הקלטת וידאו סטנדרטי ובסביבה עם בקרת תאורה.
- מחייב הכשרה בתצפית התנהגותית כדי להבטיח ביצוע עקבי של הבדיקה.
- עשוי לדרוש התאמה למעקב אוטומטי ביישומים של סריקה רחבה.
- מוגבל להערכת תפקוד חזותי; אינו לוכד אופנויות חושיות אחרות.
