בידוד וכמוני Immunocytochemical אפיון של תאים ראשוניים myogenic וFibroblasts משרירי שלד אדם

המטרה הכוללת של הליך זה היא להפריד בין שתי אוכלוסיות התאים העיקריות המתקבלות מדגימות ביופסיה של שריר אנושי ביעילות ותשאול גבוהים כדי לאפשר הערכה של סמנים פנוטיפיים וגורמי שעתוק ספציפיים. זה מושג על ידי דיסוציאציה ראשונה, דגימת ביופסיה של שריר אנושי לתרחיף תא בודד בשלב השני. לאחר תרבית של שבעה ימים, התאים מופרדים על ידי חרוזים מגנטיים חיסוניים הממוינים ל-CD 56 חיובי, שהם תאים מיוגניים ושברים שליליים CD 56, שהם הפיברובלסטים.

לאחר מכן התאים נצבעים ומצולמים עבור הסמנים הפנוטיפיים והחלבונים הרצויים. בסופו של דבר, ניתן להשתמש במיקרוסקופ אימונופלואורסצנטי וניתוח תמונה כמותי כדי למדוד את העוצמה של גורמי שעתוק מקומיים גרעיניים נבחרים בתוך אוכלוסיות התאים הממויינות. היתרונות העיקריים של טכניקה זו, המשתמשת במיון תאים מגנטיים חיסוניים על פני שיטות קיימות כמו מיון תאים מופעלים פלואורסצנטיים, הם שהיא עדינה, מאפשרת מיון מצוין של תאי שריר ראשוניים אנושיים בעלי תפוקה וכדאיות גבוהים וניתנת לביצוע במהירות.

ההשלכות של טכניקה זו משתרעות לקראת הגברת הבנתנו את הבסיס התאי של ניוון שרירי הפיברו השומני שנצפה בהזדקנות, כמו גם במספר פתולוגיות שרירים לבודד את תאי המבשר שמקורם בשריר בהקדם האפשרי לאחר קבלת הביופסיה. ראשית, קבע את משקל דגימת הרקמה ולאחר מכן נפח את השריר במדיום בסיסי מספר פעמים כדי לשטוף את הדגימה מעודפי דם. הניחו לשריר לשקוע בטמפרטורת החדר למשך 30 עד 60 שניות ואז שאפו את כל השניים עד שלושה מיליליטר האחרונים של המדיום מהצינור.

לאחר מכן, הפוך את הצינור על צלחת פטרי סטרילית כדי לאפשר לנוזל שנותר לשאת את השריר אל הצלחת. כעת נקה את הדגימה מכל חתיכות גלויות של כל שומן או רקמת חיבור ברורה. לאחר מכן סובב את הצלחת כדי לגייס את המדיה הנותרת, ולאחר מכן שאב את כל המדיה והוסף שלושה מיליליטר של קולגנאז אחד ותמיסת אנזים דיסב לכל 100 עד 400 מיליגרם רקמה, וחתוך את דגימת השריר לחתיכות קטנות מאוד של מילימטר עד שניים קוביות.

כאשר הדגימה טחונה מספיק. השתמש בפיפטה רחבה של 25 מיליליטר חזיר כדי להעביר את שברי הרקמה ותמיסת האנזים לצינור חרוטי סטרילי של 10 עד 20 מיליליטר. שטפו את הצלחת בשלושה מיליליטר נוספים של תמיסת אנזים ולאחר מכן השתמשו בפיפטה של 10 מיליליטר כדי להעביר את כל שברי השריר שנותרו לצינור.

מניחים את הצינור על 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. החזרת תרחיף הרקמות כל 15 דקות עם פיפטה של 10 מיליליטר. לאחר מכן סיים את הדיסוציאציה האנזימטית עם כמות שווה לפחות של מצע גידול טרי ומחומם מחדש.

לאחר מכן, העבירו את תרחיף התא דרך מסנן של 100 מיקרומטר כדי להסיר חתיכות גדולות של פסולת ולאחר מכן צנטריפוגה את התאים לחיים. השעו את הגלולה בשבעה עד שמונה מיליליטר של מצע גידול, ולאחר מכן דגרו את התאים בבקבוק תרבית רקמה T 25 לא מצופה. 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך שבעה ימים.

בסוף השבוע, טריפסין מסתכל על התא חד-שכבתי במשך שלוש דקות. כאשר התאים מתנתקים, הוסף חמישה עד 10 מיליליטר של צמיחת שרירי שלד, בינוני למניעת עיכול יתר ויישום התאים על ידי צנטריפוגה. לאחר מכן, לאחר הספירה, שמור חלק מהתאים לאפיון סמן שושלת התאים ושטוף את התאים הנותרים ב-15 מיליליטר של רווח צנטריפוגה PBS.

הפעם השעו מחדש את הגלולה ב-170 מיקרוליטר של מאגר מיון מקסימלי בטמפרטורת החדר ופיפטה בעדינות כדי להחיות אותה. השעו את התאים ב-35 מיקרוליטר של מיקרו-חרוזים מגנטיים מצומדים נגד CD 56 מעורבבים היטב. מערבבים את תמיסת התאים כמה פעמים על ידי פיפטה ומדגרים את התערובת למשך 15 דקות של ארבע מעלות צלזיוס עם צמחייה עדינה.

בנקודת האמצע לאחר הדגירה יש לשטוף את תמיסת התא והחרוזים עם 10 מיליליטר של צנטריפוגת חיץ מיון וראוס. השעו את הגלולה במיליליטר אחד של מאגר מיון טרי. לאחר מכן, יש לשמן את מסנן ההפרדה והעמודה עם 500 מיקרוליטר של מאגר מקור.

ואז מיד מערבבים ומעבירים את כל המיליליטר של תרחיף התאים דרך מסנן ההפרדה המקדים ולתוך העמודה, שוטפים את העמודה שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של שטיפת כוח חיץ מקור, אוספים את שבר הפיברובלסטים שאינו שומר, עוברים דרך העמוד לצינור חרוטי סטרילי של 50 מיליליטר המכיל כמות קטנה של מדיום גידול. לאחר מכן הסר את העמודה מהמגנט ולחץ את הבוכנה לחלק העליון של העמודה כדי לאסוף את שבר התא החיובי CD 56. בצינור חרוטי נפרד של 50 מיליליטר המכיל צמיחה חמה, נפלט מדיום גידול בינוני משלב זה.

אם יש לבצע מיון כפול, שקול את שברי התאים שנאספו החיוביים והשליליים. אם נדרש מקור כפול לטוהר נוסף, אל תניח מדיה בצינור האיסוף החיובי CD 56 במיון הראשון, אלא חזור על השלבים החל מהמסנן ושימון העמודה בנקודת הקצה הניסיונית המתאימה. תקן את תרביות התאים החיוביות CD 56 במדיום התרבית שלהן, תוך שימוש בנפח שווה ערך של קר כקרח, 8%para פורמלדהיד.

10 הדקות עם צמחייה עדינה. לאחר מכן שאפו את הקיבוע ושטפו את התאים פעמיים עם PBS כדי להכתים את האנטיגנים על פני התא. חסום את התאים למשך שעה לפחות ב-1%BSA ב-PBS, ולאחר מכן סמן את התאים עם הנוגדנים הראשוניים ולאחר מכן המשניים הרלוונטיים.

בצע אופטימיזציה של הגדרות עוצמת הלייזר והחשיפה של הגלאי הרלוונטיות למיקרוסקופ ולכתם שלך. לפני ההדמיה, התאים מצלמים את תמונות התאים במספר ערוצי הזיהוי הרצוי וביותר משישה שדות ראייה שונים. לניתוח, פתחו את קובצי תמונת TIFF המתאימים וגררו את התמונות זו לזו כדי לכסות את הערוצים המתאימים המתאימים.

כל ערוץ יופיע כשכבה נפרדת בחלונית השכבות. לאחר מכן בחלון הניתוח, בחר בחר נקודות נתונים ולאחר מכן התאם אישית ובחר את המדידות הרצויות. כדי לנתח את עוצמת הקרינה הגרעינית, פתח את תיבת הדו-שיח של טווח הצבעים ובחר צבעים שנדגמו מהתפריט הנפתח.

לאחר מכן החזק את מקש Shift, בחר את הצלילים הספציפיים לגרעינים המסומנים לחצו על 'שמור' לאחסון מסיכת בחירה זו של טווח הצבעים לשימוש עם תמונות אחרות שנבחרו באותה הפעלה. לאחר בחירת הגרעינים יש לכתוב לחץ ולבחור מילוי.

לאחר מכן בחר שחור מהתפריט הנפתח ואשר שהאטימות מוגדרת ל-100%לאחר מכן, לחץ על בחר והפוך. לאחר מכן לחץ לחיצה ימנית ובחר שוב מילוי ובחר מילוי לבן מהתפריט הנפתח. בצע אלגוריתם פרשת מים כדי להפריד בין כל הגרעינים החופפים חלקית בשכבה הגרעינית הבינארית כעת.

עבור לבחירה ואז טווח צבעים, ולאחר מכן צללים כדי לבחור את הגרעינים המופרדים הבודדים. לאחר מכן העבירו את הבחירה לשכבה הכוללת תמונה בגווני אפור של 16 סיביות של הסמן הרצוי ולחצו על הקלט מדידות. לבסוף, ייצא את המדידות שנבחרו כקבצי טקסט לתוכנת הניתוח המתאימה להמשך עיבוד שמן.

צביעה אדומה של אוכלוסיות התאים המטוהרים בשילוב עם צביעה חיסונית לסמני שושלת אדיפוגניים ומיוגניים מגלה שרק חלק הפיברובלסטים מסוגל להתמיין אפיגני כאשר הצטברות מסיבית של שומן על ידי הפיברובלסטים נראית לעין בלתי ועם הדגמה נוספת של הטרנספורמציה המלאה שלהם על ידי ביטוי חזק של גמא PPAR גרעינית על ידי תאים אלה ביום ה-15 לטיפול, תאים אלה שחררו את כל האנטיגן של רקמת החיבור TE 7A שנותר על המצע שלהם. לעומת זאת, תאים מיוגניים שומרים על הפנוטיפ הנורמלי שלהם, כולל ביטוי השרשרת הכבדה של דסמין ומיוזין ללא ויסות של ביטוי גמא PPAR גרעיני. באיור זה, מוצגת דוגמה לניתוח כמותי של שדה של תאים מיוגניים חיוביים לדזמונד והשדה ממנו התקבלו נתונים אלה הממחישים את השונות של ביטוי מיוגני בגרעינים בודדים בצפיפות הזריעה ונקודת הזמן הספציפית הזו.

בגרף זה מודגמת התועלת של השיטה להשוואה ישירה של רמות גורמי שעתוק בסוגי תאים שונים בתא לפי רמת תא. לדוגמה, פיברובלסטים שליליים אלה של CD 56 מבטאים רמה גבוהה של גורם השעתוק האדיפוגני הגרעיני, PPAR gamma, בעוד שתאים מיוגניים חיוביים ל-CD 56 שומרים רק על רמות נמוכות מאוד של גורם שעתוק קולטן גרעיני לאחר חשיפה למדיום המעורר אדיפוציטים. טכניקה זו מאפשרת לחוקרים בתחום הביולוגיה של השרירים לחקור את המנגנונים של החלטות גורל התא בדגימות שריר אנושיות בריאות או פתולוגיות.

לאחר צפייה בסרטון זה, ראשית אמורה להיות לך הבנה טובה כיצד להשיג תשואות גבוהות של תאים שמקורם בשריר אנושי מטוהרים ומאופיינים היטב, ושנית, כיצד לבצע ניתוח כמותי אובייקטיבי של מרכיבים תאיים המזוהים על ידי צביעה אימונו-פלואורסצנטית.