הפקת DNA שיטה היברידית להערכה איכותית וכמותית של הקהילות בקטריאלי מדוגמאות ייצור עופות
10 בדצמבר 2014
פותחה שיטת מיצוי DNA היברידית אוטומטית למחצה לשימוש עם דגימות ייצור עופות סביבתיות והדגימה שיפורים על פני שיטת מיצוי מכנית ואנזימטית נפוצה מבחינת ההערכות הכמותיות והאיכותיות של כלל קהילות החיידקים.
המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לפתח טכניקת מיצוי DNA חדשה המשלבת הומוגניזציה מכנית של DNA עם הסרת מעכבי PCR ותקן הזהב ושיטת המיצוי הסומטי לדגימות סביבתיות לאורך רצף ייצור העופות. זה מושג על ידי חלוקה תחילה של דגימה סביבתית לצינורות מיקרו צנטריפוגות המכילים תערובת של חרוזים כדי להומוגניזציה יעילה של הדגימות הסביבתיות המורכבות. השלב השני הוא למקם את הצינורות בהומוגנייזר בעל עוצמה גבוהה כדי לשחרר ביעילות חומצות גרעין מתאי החיידקים ומהמטריצה הסביבתית.
לאחר מכן, ההומוגנאט משמש כחומר המוצא לשיטת מיצוי ה-DNA האנזימטי בתקן הזהב באמצעות שלב קשירת עיכוב ה-PCR. השלב האחרון הוא למקם את הדגימות בתחנת עבודה רובוטית לחילוץ DNA כדי לספק למשתמש דגימות DNA שחולצו הניתנות לשורה של יישומים במורד הזרם, בסופו של דבר ניתוח PCR ומיקרוביום כמותי באמצעות פלטפורמת MiSeq מאלומיניום, שימשו כדי להראות ששיטה היברידית חדשה זו מספקת את השילוב הטוב ביותר של הערכות איכותיות וכמותיות של סך קהילות החיידקים בהשוואה לעיבוד דגימות בשיטת מיצוי מכני או אנזימטי לבד. שיטה זו מספקת תובנה לגבי ניתוח קהילות מיקרוביאליות לאורך רצף ייצור העופות, אך ניתן ליישם אותה גם על מערכות חקלאיות אחרות כגון בקר חזירים או ייצור יבולים המכילים דגימות סביבתיות מורכבות דומות.
מישתדגים את ההליך הזה היום תהיה קייטלין גריפין, סטודנטית במעבדה שלי. כדי להתחיל בניסוי, הגדר אמבט מים ל 95 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שקלו שלושה שכפולים של 0.33 גרם כדי לנתח בסך הכל גרם אחד של טמפרטורת החדר, אדמה או חומר צואה לכפפות החלפת צינור ET של מטריצת ליזינג של שני מיליליטר בין דגימות.
הוסף 825 מיקרוליטר של מאגר נתרן פוספט ו-275 מיקרוליטר של תמיסת קדם ליזה או PLS לצינור דגימה. לאחר מכן מערבל את הדגימות למשך 15 שניות לאחר ערבוב הצנטריפוגה של הצינורות ב-14,000 Gs למשך חמש דקות. שפכו את הסופרנטנט והוסיפו 700 מיקרוליטר של חיץ A SL. לאחר מכן מערבב את הצינור למשך חמש שניות.
פתח צינור אחד בכל פעם כדי למנוע זיהום. לאחר מכן, ודא שיש מרווח ראש של 10% מהנפח הכולל בצינור החרוטי לפני הכנסת הדגימות למכשיר ההכנה המהירה 24. הומוגניזציה של הדגימות במהירות של שישה מטרים לשנייה למשך 40 שניות.
שימו לב להבדל בין הכנה מהירה 24 למערבולת לאחר הומוגניזציה. צנטריפוגה את הדגימה ב-14,000 Gs למשך חמש דקות. העבירו את הסופרנטנט לצינור מיקרו צנטריפוגה סטרילי של שני מיליליטר לדגימה הנותרת בצינור ה-ET של מטריצת הליזינג ב-700 מיקרוליטר נוספים של מאגר SL הומוגניזציה וצנטריפוגה.
באמצעות ההגדרות הקודמות, הניחו תפסי נעילה מפלסטיק על צינורות הדגימה כדי להבטיח שהם לא ייפתחו וידגרו את הסופרנטנטים באמבט מים של 95 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר מכן, פתח כל צינור מיקרו צנטריפוגה כדי לשחרר את הלחץ, כסה מחדש את הצינורות ומערבל אותם למשך 15 שניות. צנטריפוגה את הדגימות ב-14,000 GS למשך דקה אחת.
לאחר הצנטריפוגה העבירו 1.2 מיליליטר של הסופרנטנט לצינור מיקרו צנטריפוגה סטרילי של שני מיליליטר. לאחר מכן הנח את חבילת השלפוחית המכילה את הלשונית ישירות מעל צינור המיקרו צנטריפוגה הפתוח ודחף בעדינות את הלשונית החוצה מחבילת השלפוחית לתוך הצינור. כדי למנוע מגע בין לשונית העיכוב X לשפופרת, הוסף לשונית עיכוב X אחת לכל דגימה.
לאחר מכן, מערבל את הצינורות עד שהדגימות הופכות לנוזל לבן אחיד. דגרו את הדגימות למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר וצנטריפוגה אותן ב-14,000 גבינה למשך חמש דקות תוך הימנעות מחלקיקים שנותרו בתחתית הצינורות. העבירו את כל הנוזל לצינור מיקרו צנטריפוגה סטרילי של 1.5 מיליליטר.
ואז צנטריפוגה את הצינורות במלוא המהירות למשך חמש דקות. לפני שתתחיל בטיהור DNA אוטומטי, ודא שתחנת העבודה מכילה את הכמות המתאימה של קצות מסננים ומאגרים. לאחר מכן, הוסף צינורות אלוציאן וצינורות סינון למתאמי הרוטור והוסף 400 מיקרוליטר מכל דגימה לחריץ האמצעי של מתאם הרוטור.
הנח את מתאמי הרוטור בצנטריפוגה של תחנת העבודה וודא שכל מכסי צינור המיקרו צנטריפוגה מאובטחים כראוי בתוך מתאם הרוטור. הוסף תמיסת חלבון K לצינור מיקרו צנטריפוגה סטרילי של 1.5 מיליליטר והנח אותו בחריץ A בתחנת העבודה. הוסף שני צינורות מיקרו צנטריפוגה עם נעילה בטוחה של מיליליטר לחלק השייקר של תחנת העבודה, וודא שהמכסים של צינורות הדגימה ממוקמים היטב.
באמצעות מסך המגע בתחנת העבודה, בחר את פרוטוקול זיהוי פתוגנים של צואה אנושית של צואה DNA וקרא את המסכים הבאים כדי לוודא שתחנת העבודה נטענה כהלכה. לאחר העברת כל מסכי הבדיקה, בחר התחל כדי להפעיל את הפרוטוקול. לאחר מכן הסר את הדגימות ממתאמי הרוטור.
שלב את שלושת טיהורי השכפול עבור דגימה בודדת באמצעות מערכת מבוססת אידוי צנטריפוגה. הוצא מחדש את הדגימה לנפח סופי של 100 מיקרוליטר עם מאגר טריס EDTA. לבסוף, כסו את הדגימות והניחו אותן במינוס 20 מעלות צלזיוס עד שהן נחוצות לניתוח במורד הזרם.
גרף זה מדגים כי השיטה המכנית סיפקה באופן עקבי את הערכות השפע הגבוהות ביותר של גנים מנורמלים חיידקים עבור דגימות צואה ופסולת. לשיטה האנזימטית היו ההערכות הנמוכות ביותר בכל המקרים. שיטת המיצוי ההיברידית החדשנית ייצרה את השילוב הטוב ביותר של הערכות איכותיות וכמותיות של קהילת החיידקים הכוללת.
מבין שלוש שיטות המיצוי שנבדקו. כעת אמורה להיות לך הבנה טובה יותר כיצד לבצע את שיטת מיצוי ה-DNA ההיברידית האוטומטית למחצה הזו ולראות את התועלת שלה בהערכה איכותית וכמותית של קהילות מיקרוביאליות מדגימות סביבתיות מורכבות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פותחה שיטת מיצוי DNA היברידית חצי-אוטומטית חדשנית עבור דגימות מייצור עופות סביבתי. שיטה זו הראתה שיפורים הן בהערכות הכמותיות והן בהערכות האיכותיות של קהילות חיידקים כוללות, בהשוואה לשיטות מיצוי מסורתיות.
מרכיבי המחקר המרכזיים
תחום מדע
- מיקרוביולוגיה
- מדעים סביבתיים
- ביוטכנולוגיה
רקע
- מיצוי DNA הוא קריטי לניתוח של קהילות מיקרוביאליות.
- שיטות מסורתיות מתקשות לעיתים קרובות עם דגימות סביבתיות מורכבות.
- שיפור טכניקות המיצוי יכול לשפר יישומים המשכיים (downstream).
- מחקר זה מתמקד בסביבות של ייצור עופות.
מטרת המחקר
- פיתוח טכניקת מיצוי DNA היברידית.
- שילוב של הומוגניזציה מכנית עם מיצוי אנזימטי.
- שיפור הניתוח של קהילות מיקרוביאליות בייצור עופות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- דגימות סביבתיות הומוגניזדו באמצעות חרוזי Bead.
- הומוגניזר בעל הספק גבוה שימש לשחרור חומצות גרעין.
- ההומוגנאט עובד בשיטה אנזימטית המהווה את "תקן הזהב" (gold standard).
- עמדת עבודה רובוטית סייעה בהפקת דגימות DNA.
תוצאות עיקריות
- השיטה ההיברידית סיפקה תוצאות איכותיות וכמותיות מעולות יותר.
- היא הניבה ביצועים טובים יותר מאשר שיטות מיצוי מכניות או אנזימטיות בלבד.
- התוצאות תוקפו באמצעות qPCR ואנליזת מיקרוביומה.
- השיטה ישימה למערכות חקלאיות אחרות עם דגימות מורכבות.
מסקנות
- השיטה ההיברידית החדשנית משפרת את מיצוי ה-DNA מדגימות סביבתיות.
- היא מספקת תובנות בעלות ערך לגבי קהילות מיקרוביאליות בייצור עופות.
- ניתן להתאים טכניקה זו לשימוש בהקשרים חקלאיים אחרים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך זה
מיצוי DNA חזק מדגימות סביבתיות מורכבות הוא קריטי לאפיון מדויק של המיקרוביום ולהערכה כמותית של קהילות חיידקים במחקר ופיתוח חקלאי. שיטת המיצוי ההיברידית משפרת את התוצאים האיכותיים והכמותיים כאחד, ובכך תומכת ברמת ביטחון חיזויית גבוהה יותר בניתוחים של קהילות מיקרוביאליות. יכולת זו היא רלוונטית באופן אסטרטגי עבור צוותי ביו-פארמה המפתחים או מתקפים מודלים הרלוונטיים למחלות וסמנים ביולוגיים תרגומיים במערכות בריאות והפקה של בעלי חיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה מקיפה של מבנה הקהילה המיקרוביאלית במטריצות מורכבות.
- משפר את הגילוי של חיידקים Gram-positive, ובכך מפחית עמימות ביולוגית בתיקוף המטרה.
- תומך בהערכה תפקודית של תרומות מיקרוביאליות לפנוטיפים של המארח.
- מקל על תעדוף הפורטפוליו על ידי אספקת נתונים מהימנים על הרכב הקהילה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק DNA באיכות גבוהה המתאים ל-quantitative PCR ולתהליכי ריצוף מיקרוביום.
- מסטנדר את תהליך המיצוי על פני סוגי דגימות מגוונים, ובכך משפר את השחזוריות של הבדיקה.
- מעלה את התפוקה ומפחית טעויות ידניות באמצעות חצי-אוטומציה.
- מאפשר סריקה אמינה של אינטראקציות מיקרוביאליות או אינטראקציות מאחסן-מיקרוביה בשלבי המשך.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאים את הערכת הקהילה המיקרוביאלית למודלים של בעלי חיים הרלוונטיים למחלה.
- תומך ברציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני במחקר בריאות בעלי חיים וחקלאות.
- משפר את קבלת ההחלטות בנוגע לקידום פרויקטים מותאם-סיכונים על ידי אספקת נתונים כמותיים ואיכותיים חסונים.
- מקל על גילוי ותיקוף של סמנים ביולוגיים בהקשרים סביבתיים מורכבים.
שילוב תהליכי עבודה (Pipeline) וזרימת עבודה
שיטת מיצוי היברידית זו מתאימה לממשק שבין הכנת הדגימה לניתוח מולקולרי המשך, ובכך היא מגשרת בין שלב הגילוי המוקדם למחקר פרה-קליני במסלולי עבודה של בריאות בעלי חיים וחקלאות.
- ביולוגיית גילוי: מספקת מיצוי DNA אמין לבדיקת השערות ולהבהרת מסלולים מיקרוביאליים.
- סריקה: מבטיחה מוכנות של הבדיקה וחזרתיות עבור אנליזות מיקרוביאליות כמותיות ואיכותיות.
- אנליטיקה: תומכת בתוצרי qPCR וריצוף מיקרוביום עבור מחקרים השוואתיים.
- מחקר תרגומי: מאפשר פרופיל חסון של קהילות מיקרוביאליות במודלים של בעלי חיים הרלוונטיים למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע זרימת עבודה סטנדרטית וחצי-אוטומטית הניתנת להתאמה לדגימות סביבתיות מורכבות ומגוונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרי קהילה מיקרוביאלית.
- ערך תפעולי: מספק מיצוי DNA סטנדרטי, הניתן לשחזור וניתן להרחבה על פני סוגי דגימות שונים.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של "המשך/עצור" (go/no-go) ויעילות הון על ידי אפשור הפקת נתונים באיכות גבוהה.
- השפעה על פורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים וקידום של תוכניות מו"פ לבריאות בעלי חיים וחקלאות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בביולוגיה מולקולרית ובטיפול בדגימות סביבתיות.
- דורש גישה להומוגניזטורים בעלי הספק גבוה ולתחנות עבודה אוטומטיות להפקת DNA.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים לצורך אימוץ הפרוטוקול והשוואת נתונים.
- ניתן להתאמה למטריצות סביבתיות שונות בעלות מורכבות דומה לדגימות מייצור עופות.
- מגבלות פוטנציאליות כוללות השקעה ראשונית בציוד ואופטימיזציה של הפרוטוקול עבור סוגי דגימות חדשים.
