פיתוח במבחנה מערכת מודל לחקר האינטראקציה של Equus Caballus IgE עם קולטן גבוה הזיקה שלה FcεRI

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא למדוד את כמות השחרור המתווך התלוי ב-IgE מתאי לוקמיה בזופילית RAD. תסמיני האלרגיה נגרמים משחרור מתווכים כמו היסטמין. כעת, היסטמין אינו המתווך היחיד שמשתחרר על ידי בזופילים הם תאי פיטום.

סך כל המתווכים המשתחררים על ידי תאים אלה מביא לסימנים ותסמינים של רגישות יתר מיידית ומעוכבת. כעת, בני אדם הם לא האורגניזמים היחידים שסובלים מאלרגיה וגם כלבים וסוסים סובלים. על מנת לפתח את המחקר עוד יותר ולמצוא טיפולים נגד אלרגיה כגון חיסונים, נדרשת בדיקת שחרור כדי לכמת את כמות המתווכים המשוחררים, אם בכלל, מהטיפול במחקר.

זו הסיבה לבדיקת שחרור זו. המתווך RBL ששוחרר עבור המערכת האנושית פותח ופורסם לראשונה על ידי איאן והוק בשנת 1986. מאוחר יותר הוא פותח עבור מערכת DOC וכעת עבור מערכת הסוסים.

השינויים פשוטים כמו שינוי החלבונים המעניינים. החדשות בקו התאים היו לוקמיה של עכברוש באסו או RBL שני קו תאים H 3.1 המבטא את שרשרת אלפא של קולטני FNT ffc סרין R אחד לצפיפות תאים של 500,000 תאים למיליליטר. הוסף את נוגדן ה-IgE המעניין לריכוז סופי של ננוגרם אחד למיליליטר.

מוסיפים 100 מיקרוליטר מהתערובת לצלחת אדמה 96 ודוגרים למשך 16 שעות בחום של 37 מעלות. זה מאפשר לתאים להיצמד למשטח הבאר והנוגדן נקשר לשטיפת הקולטן שלו. פי שניים מהמדיה המכילה את הנוגדנים הלא קשורים הנותרים ותאים מתים עם 100 מיקרוליטר של מאגר שחרור חם של 37 מעלות.

השליכו את המאגר מהכביסה האחרונה והחליפו ב-100 מיקרוליטר של האנטיגן המעניין בריכוז העניין. לאחר דגירה של 20 דקות ב-37 מעלות, העבירו 50 מיקרוליטר של SUP natin המכיל את מתווכי השחרור לבאר חדשה והחליפו את הסופרנטנט הנותר במאגר טריטון X של 50 מיקרוליטר כדי למקם את התאים ולשחרר את המתווכים הנותרים בתוך התאים. ב -50 מיקרוליטר של 2 מיליון בטא hx מולארי.

מצע לימים רבים מומס במאגר ציטראט. לאחר דגירה של שעתיים בחום של 37 מעלות, מוסיפים 150 מיקרוליטר של טריס מאגר לכל באר והופכים את הבאר לצהובה. מדוד את ספיגת הצבע ב-405 ננומטר לאחר 16 שעות.

מחממים את מאגר בדיקת השחרור, הידוע גם בשם Ian Buffer ב-37 מעלות. הכן גם את שיפוע הריכוז של האנטיגן במאגר השחרור בריכוזים. אפס 0.1 1 10, 100, 1000 ו -10, 000 ננוגרם למיליליטר.

ואז לחמם ב-37 מעלות. שטפו את הבארות על ידי החלקה מהירה של הכלי כדי להסיר את המדיה והוסיפו בעדינות 100 מיקרוליטר של חיץ שחרור חם לכיוון קירות הבארות. זאת כדי להפחית את הלחץ של התאים מהפרש הטמפרטורה, מה שגורם להם לשחרר מתווכים בטרם עת.

יש לשטוף את המנה פעמיים. השליכו את מאגר השחרור הסופי, שטפו והוסיפו 100 מיקרוליטר אנטיגן, החל מריכוז אנטיגן אפס בשורה A לבקרה השלילית, ויורדים בשיפוע הריכוז משורות B ל-G ולבסוף לפרוסות Triton X, חוצץ בשורה H. דוגרים את הצלחת למשך 20 דקות בחום של 37 מעלות.

זו הנקודה בה התאים משחררים מתווכים לאחר תקופת הדגירה. העבירו 50 מיקרוליטר מהנוזל בכל באר לבאר המתאימה. בעמודה 7 עד 12 יש להוציא החוצה לחלוטין ולהשליך את הנוזל הנותר במיקומים 1 עד 6 ולהחליף ב-50 מיקרוליטר של מאגר ליזה Triton X.

הוסף 50 מיקרוליטר מהמצע המוכן לכל 96 בארות המנה. דגירה בחום של 37 מעלות למשך שעתיים. הבטא H, ימים רבים הופך את הסובסטרט לארבעה ניטרו פנול.

לאחר תקופת הדגירה, עצרו את התגובה על ידי הוספת 150 מיקרוליטר של טריס אגר, והפכו את ארבעת הניטרו פנול לצבע צהוב. קרא את הלוח באמצעות ספקטרופוטומטר צלחת ב-405 ננומטר. לאחר מדידת נתוני הספיגה, חשב את הכמות הכוללת של מתווכים בתוך התאים במיקום הבארות A אחד על ידי הכפלה.

הבאר המקבילה שלו במיקום שבע על שניים והוספת התוצאה לערך באחד. הסיבה לכך היא שבמהלך הניסוי, יש לנו את ה-supinate המכיל את התנגדות מתווכי השחרור A כאשר העברנו אותו להתנגדות באר חדשה. שבע.

חזור על החישובים עבור שאר הבארות. חשב את אחוז מתווכי השחרור באופוזיציה לבאר, A שבע מסך המתווכים המחושבים בתוך התאים על ידי הכפלת ערך המיקום A שבע בשניים. שוב, מכיוון שבמהלך הניסוי, יש לנו את הסופרנט המכיל את מתווכי ריס.

כאשר העברנו אותו לחדש, אז הכפילו את המכפלה הזו ב-100 וחלקו את המכפלה הזו בערך הכולל המתאים של מתווכים בתוך התאים עבור מיקום זה. זה נותן את אחוז מתווכי השחרור לנפיחות. חזור על החישובים עבור שאר הבארות מכיוון ששש הגלים בכל שורה מאותגרים על ידי אותו ריכוז של ממוצע אנטיגן.

ערכים אלה וחישוב סטיית התקן מתווים ערכים אלה בגרף באופן הבא. הגרף מראה שככל שריכוז האנטיגן עולה, משתחררים מתווכים נוספים עד שהוא מגיע לשיא של 100 ננוגרם למיליליטר, ולאחר מכן שחרור המתווך יורד עם הגדלת ריכוז האנטיגן. תוצאת הניסוי הסופית אמורה להיראות כמו הגרפים הללו כפי שניתן לראות בגרף B.בדיקת שחרור הבקרה בכחול בהיר אינה מכילה נוגדנים IgE ולכן לא מראה שינוי בשחרור המתווך עם עלייה בריכוז האנטיגן.

השוו זאת לתוצאת הניסוי בכחול כהה, שיכול להכיל נוגדן IgE. זוהי דוגמה לחיסון נגד IgE שנבדק לבטיחות. ברור מהגרף הזה באדום שהסרום נגד IgE מקשר בין הקולטנים על פני התא וגורם לתאי ה-RBL להתפרק בדיוק כפי שניתן לראות בביקורת החיובית בסגול בהשוואה לבקרה השלילית באפור, מה שהופך את החיסון הזה ללא בטוח.

בדיקה זו שימושית מאוד מכיוון שהיא יכולה למדוד שחרור מתווך, או פיגור שלו בעת בדיקת תרופות או חיסונים פוטנציאליים נגד אלרגיה יכולה להיות מותאמת גם למערכות הכלבים או הסוסים האנושיים כפי שהוכח הבדיקה יכולה לקבוע את החסימה המוצלחת או החסימה הלא מוצלחת של שחרור המתווך בעת בדיקת נוגדנים נגד אלרגיה.