התאמת שיטות סנונית Videofluoroscopic אדם מחקר כדי לזהות ולאפיין בליעה במודלי Murine מחלות
1 במרץ 2015
מחקר זה התאים בהצלחה שיטות מחקר בליעה וידאופלואורוסקופיות אנושיות (VFSS) לשימוש עם מודלים של מחלות עכברים במטרה להקל על מחקר דיספגיה תרגומית.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לחקור את תפקוד הבליעה במכרסמים המתנהגים בחופשיות, המכונה מחקר בליעה פלואורוסקופית בווידאו או VFSS תחילה. תא האכלה בנוי כדי לכלוא מכרסמים בחלל קטן במהלך הבדיקה. השלב השני הוא ביצוע התניה התנהגותית עם פתרון בדיקה כדי להבטיח השתתפות מקסימלית.
השלב הבא הוא ביצוע בדיקות VFSS עם העכברים המותנים מראש. לבסוף, סרטונים נתונים לניתוח מסגרת אחר מסגרת כדי לכמת פרמטרים של בליעה. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בכלי הערכה חדשני זה כדי לזהות ולאפיין דיספגיה במודלים של מחלות שיקוף ולספק סמנים ביולוגיים פונקציונליים לשימוש בניסויים פרה-קליניים.
לראשונה עלה לנו הרעיון להשתמש בתאי תצפית מכיוון שבדיקת VFSS בבני אדם היא וולונטרית ובלתי מרוסנת, ורצינו לחקות מקרוב את ההליך הקליני האנושי. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות דומות הוא שהיא מעוררת במהירות התנהגויות האכלה מרצון במכרסמים כדי לאפשר בדיקה מהירה של כל שלבי הבליעה. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו בניתוח וידאו מכיוון שקשה להבחין בתנועות הקטנות והמהירות של בליעה ועכברים.
התחל בהרכבת תאי התצפית לאחר מכן, הרכיב מערכת אספקת מזרק כדי לספק פתרון לקערות יתד במהלך הבדיקה. לאחר ההרכבה, הנח את תא התצפית על מעלית מספריים ממונעת למיקום מרחוק. היתרון העיקרי של שולחן הרמת המספריים הנשלט מרחוק הוא בטיחות קרינה משופרת לחוקרים תוך שמירה על מכרסמים המתנהגים בחופשיות בשדה הראייה של הפלואורוסקופיה.
הכן את העכברים על ידי הרגלם לתא התצפית והכפפתם לתקופת ויסות מים למשך הלילה. כשהוא מוכן לבדיקה, הוציאו את החדר מהכלוב ונקו אותו היטב. השתמש בטוש מחיקה יבש כדי לתייג כל צינור מנוקה לפני החזרתו לכלוב הביתי.
לאחר מכן, הכינו את תמיסת ה-iohexol בטעם שוקולד כדי להגדיר את סביבת הפלואורוסקופיה. השתמש בתא תצפית רזרבי ובקערת יתד כדי לקבוע את הגובה והמיקום האופטימליים בתוך קרן הפלואורוסקופ המאפשרים הדמיה של שתייה במישור הרוחבי. הגדר את קצב הפריימים של הפלואורוסקופיה ל-30 פריימים לשנייה.
ניתן להשתמש בקצבי פריימים גבוהים יותר אם הם זמינים. ודא שסמן כיול רדיו-אפק ממוקם כראוי על מצלמת הפלואורוסקופ כך שהוא יהיה גלוי על צג התצוגה במהלך כל הבדיקה. שלב זה הכרחי כדי לאפשר כיול של מדידות אורך כדי להפחית את הלחץ עקב טיפול.
התבונן בכלוב עד שעכבר נכנס בחופשיות לתא התצפית. לאחר הכניסה, הרם את התא מהכלוב והצמד בעדינות את מכסה הקצה השני. בבדיקות חוזרות ונשנות ניתן לשדל בקלות עכברים להיכנס לתא כאשר הוא מונח לפניהם בתוך הכלוב, או כאשר הוא תלוי על ידי הזנב מעל פתח החדר.
מקם את תא התצפית בתוך מכונת הפלואורוסקופיה כדי להתחיל בבדיקת VFSS במישור הרוחבי. לאחר מכן, השתמש במערכת אספקת מזרק כדי למלא את קערת היתד בתמיסת iohexol בטעם שוקולד. התחל את הקלטת הווידיאו פלואורוסקופיה.
כאשר העכבר מתחיל לשתות במהלך הבדיקה, השתמש בשולחן ההרמה הנשלט מרחוק כדי להתאים את מיקום תא התצפית כך שמנגנון הבליעה יהיה גלוי בשדה הראייה. השהה את ההקלטה בכל פעם שהעכבר מתרחק מקערת היתד כדי למזער את משך החשיפה לקרינה. המשך את ההקלטה כאשר העכבר חוזר לקערת היתד, מלא מחדש את קערת היתד לפי הצורך.
המטרה היא לתעד כמה התקפים ארוכים של שתייה מתמשכת, האופיינית לרוב העכברים. במהלך שתי הדקות הראשונות של הבדיקה, הפסק את הבדיקה אם העכבר לא שותה תוך חמש דקות, החזר עכברים שאינם תואמים לכלוב הביתי לבדיקה חוזרת במועד מאוחר יותר באותו היום. אין לחרוג מתקנת המים של 24 שעות.
בעת בדיקת מספר עכברים מאותו כלוב ביתי. נקו את קערת היתד והצינור עם מגבת נייר יבשה בין העכברים. חתוך את קצה צינור ה-PE לפי הצורך.
אם נלעס במהלך הבדיקה, נקה את תא התצפית לפי הצורך כדי להסיר כל יוהקסול שניתז על דפנות החדר. שוטפים את החדר במי ברז ומייבשים במגבת נייר. השתמש בתוכנת עריכת וידאו המאפשרת ניתוח מסגרת אחר מסגרת של הקלטות הפלואורוסקופיה של הווידאו.
כדי לכמת את פרמטרי הבליעה המעניינים, לפחות שני סוקרים מיומנים צריכים לנתח כל סרטון בצורה עיוורת. הסוקר הראשי צופה בכל סרטון כדי לזהות ולנתח שלושה עד חמישה התקפי שתייה ארוכים. קריטריון זה מבוסס על מחקרי בליעה לא רדיוגרפיים שפורסמו המראים כי פרמטר זה מספיק לניתוח סטטיסטי.
לאחר מכן, הסוקר המשני מנתח באופן עצמאי את שלושת עד חמישה המדדים לפרמטר בליעה עבור כל עכבר שזוהו ונותחו בתחילה על ידי הסוקר הראשי. לאחר מכן מזוהים פערים של בודקים עבור כל עכבר ומנותחים מחדש עד להגעה לקונצנזוס של 100%. לאחר מכן מחושבים הערכים הבלתי מעורערים עבור כל פרמטר בליעה כדי לקבל את הערך הממוצע עבור כל עכבר.
כאשר מתקבלים פחות משלושה מדדים עבור פרמטר בליעה, הזן ערך חסר במסד הנתונים הסטטיסטי עבור מדד זה. דוגמאות אלה הושגו באמצעות מיקום מערכת פלואורוסקופיה באנרגיה נמוכה. אפשר הדמיה של כל הראש ואזור בית החזה הפרוקסימלי.
נקודת ההדק של הבליעה מרוכזת בשדה הראייה. מיקום שני מאפשר הדמיה מנקודת ההדק של הבליעה לצומת הקיבה והוושט. שימו לב, הבולוס העובר דרך הוושט הדיסטלי גם בהגדרת ההגדלה הנמוכה ביותר.
מבנים גרמיים של הראש והצוואר נראים בקלות באמצעות מערכת פלואורוסקופיה באנרגיה נמוכה. מבנים אנטומיים נבדקים גם בהגדלה גבוהה יותר כדי לאפשר כימות של מספר פרמטרים נוספים של בליעה. תרשים זה מציג ממצאים ראשוניים מייצגים עבור שני פרמטרים של בליעת VFSS, קצב הבליעה וקצב הבליעה בין הבליעות היה איטי משמעותית עבור עכברי SOD אחד בהשוואה לגיל C 57.
עכברים וביקורת בין מרווח הבליעה לא היה שונה באופן משמעותי בין הקבוצות. לאחר שליטה, ניתן להשלים את צילום הווידאו תוך קצת פחות משתי דקות לכל מסה אם הוא מבוצע כראוי. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להשתמש בתמיסת הבדיקה בטעם שוקולד תוך מספר שעות מההכנה כדי למנוע שינויים בצמיגות ובטעם שעלולים לגרום להתנהגויות הימנעות.
טכניקה חדשה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחום מדעי המוח לחקור התנהגויות הזנה ובליעה טבעיות במכרסמים בריאים ובמודלים של מחלות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע בהצלחה בדיקת VFSS של מכרסמים המתנהגים בחופשיות כדי לכמת התנהגויות האכלה אופייניות ותפקוד בליעה, אל תשכח שעבודה עם ציוד פולט קרינה עלולה להיות מסוכנת ביותר, ותמיד יש להקפיד על אמצעי זהירות לקרינה עבור זמן, מרחק ומיגון בעת ביצוע הליך זה.
סקירה כללית
מחקר זה התאים בהצלחה שיטות של בדיקת בליעה בוידאו-פלואורוסקופיה (VFSS) בבני אדם לשימוש במודלים של מחלות בעכברים, ובכך קידם מחקר תרגומי על דיספגיה. הפרוצדורה שואפת להעריך את תפקוד הבליעה במכרסמים בעלי התנהגות חופשית, באופן המדמה מקרוב פרקטיקות קליניות אנושיות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ניתוח התנהגותי
- מחקר תרגומי
רקע
- VFSS היא שיטה סטנדרטית להערכת בליעה בבני אדם.
- מחקר זה נועד לשחזר טכניקות VFSS במודלים של מכרסמים.
- השיטה מאפשרת תצפית על התנהגויות האכלה רצוניות.
- היא מספקת פלטפורמה לזיהוי דיספגיה במודלים של מחלות.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה מהימנה לחקר בליעה במכרסמים.
- יצירת סמנים ביולוגיים (biomarkers) תפקודיים עבור ניסויים פרה-קליניים.
- העמקת ההבנה של מנגנוני הדיספגיה (dysphagia) במודלים של מחלות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בניית תא האכלה לכליאת מכרסמים במהלך הבדיקה.
- התנייה התנהגותית עם תמיסת בדיקה כדי להבטיח השתתפות.
- ניתוח פריים-אחרי-פריים של סרטוני VFSS לכימות פרמטרי בליעה.
- שימוש במעלית מספריים בשלט רחוק לשיפור בטיחות הקרינה.
תוצאות עיקריות
- השיטה עוררה בהצלחה התנהגויות האכלה רצוניות במכרסמים.
- ניתוח כמותי של פרמטרי בליעה הושג באמצעות ניתוח וידאו.
- הסכמה בין הבודקים הבטיחה מדידה מדויקת של פרמטרי הבליעה.
- הטכניקה הדגימה פוטנציאל לזיהוי דיספגיה (קושי בבליעה) במודלים של עכברים.
מסקנות
- התאמה חדשנית זו של VFSS יעילה לחקר דיספגיה במכרסמים.
- השיטה מספקת כלי בעל ערך למחקר פרה-קליני של דיספגיה.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על מסגרת זו כדי לבחון דיספגיה בהקשרים של מחלות שונות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
התאמת שיטות של בדיקת בליעה בוידאו-פלואורוסקופיה (VFSS) בבני אדם למודלים של עכברים מאפשרת זיהוי מוקדם של פנוטיפים של דיספגיה במודלים פרה-קליניים של מחלות, ובכך תומכת בתיקוף מטרות ובצמצום סיכונים מכניסטיים בפיתוח תרופות למחלות ניורודגנרטיביות ונוירו-מוסקולריות. גישה זו מספקת ביומרקרים תפקודיים המגשרים בין בדיקות התנהגותיות לבין נקודות קצה קליניות, ובכך משפרת את הביטחון החזוי בזיהוי מולקולות מובילות ובהחלטות על התקדמות פרה-קלינית. על ידי כימות פיזיולוגיית הבליעה במכרסמים בעלי התנהגות חופשית, השיטה מגבירה את הרצף התרגומי משלב הגילוי ועד לשלבים הפרה-קליניים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות על ידי כימות פיזיולוגיית הבליעה כמדד תפקודי לשלמות מעגלי גזע המוח והמעגלים הנוירו-מוסקולריים.
- ערך תפעולי: מאפשר התניה התנהגותית והאכלה רצונית בחללים מוגבלים, ובכך מפחית שונות הנובעת ממתח בתהליך הפנוטיפציה של עכברים.
- ערך מדעי: תומך בהסרת סיכונים ביולוגיים (de-risking) של מטרות המעורבות בבקרת הבליעה, כגון SOD1 במודלים של ALS, על ידי קישור מניפולציה גנטית לפנוטיפים מדידים של דיספגיה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מכין מערכות ביולוגיות מתוקפות לתהליכי עבודה המשכיים על ידי סטנדרטיזציה של כימות פרמטרים של בליעה באמצעות ניתוח וידאו פריים-אחר-פריים.
- ערך תפעולי: נותן מענה לסטנדרטיזציה של הבדיקה וליכולת השחזור באמצעות קונצנזוס של שני בודקים עיוורים וקריטריונים מוגדרים לפרקי שתייה.
- ערך מדעי: מדגיש את המוכנות לסריקה ואת יכולת ההרחבה (scalability) על ידי מתן אפשרות לבדיקה מהירה של עכברים מרובים במפגש אחד באמצעות מיקום תא בשליטה מרחוק.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: דן ברלוונטיות למחלה ובסנכרון של סמנים ביולוגיים תרגומיים באמצעות זיהוי הבדלים ספציפיים לגנוטיפ בקצב הבליעה ובמרווח שבין בליעה לבליעה בעכברי SOD1 לעומת קבוצות ביקורת.
- ערך תפעולי: מתאר רצף משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי אספקת פרמטרים כמותיים של VFSS המתהם עם התקדמות המחלה.
- ערך מדעי: מתמקד בערך של הפחתת סיכונים חיזויית על ידי זיהוי 13 פרמטרים של בליעה הניתנים לכימות עקבי באמצעות פלואורוסקופיה באנרגיה נמוכה, מה שמעלה כמעט פי שניים את רגישות הגילוי בהשוואה למערכות באנרגיה גבוהה.
אינטגרציה של תהליכי עבודה וצינור עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל משלב הגילוי המוקדם ועד לזיהוי מוביל (Lead Identification) ועבודה פרה-קלינית, ותומכת בבדיקת היפותזות, הבהרת מסלולים וביסום ביולוגי של מטרות המשפיעות על התפקוד הבולברי.
- ביולוגיה של גילוי: מסביר כיצד השיטה תומכת בבדיקת היפותזות, הבהרת מסלולים או הפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי כימות מכניקת הבליעה כמדד לתפקוד מעגלים עצביים במודלים של מחלות.
- סריקה: מתאר את מוכנות הבדיקה, השחזוריות או התוצרים הכמותיים כאשר הדבר נתמך במאמר באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים, ניתוח עיוור ומדידת פרמטרים מבוססת קונצנזוס.
- אנליטיקה: מדגיש מדידות, קריאות או תוצרים סטטיסטיים המסייעים לצוותים להשוות בין תנאים, כולל קצב בליעה, מרווח בין בליעות וזמני מעבר של בולוס הנגזרים מניתוח וידאו של VFSS פריים אחר פריים.
- מחקר תרגומי: מקשר את השיטה לרציפות פרה-קלינית או להתאמת סממנים ביולוגיים רק כאשר המקור תומך בכך על ידי הדגמת הבדלים בפיזיולוגיית הבליעה התלויים בגנוטיפ, המשקפים נקודות קצה קליניות של דיספגיה.
- שימוש חוזר ארגוני: מציג את השיטה כיכולת הניתנת לשימוש חוזר ולא כטכניקה לשימוש חד-פעמי, באמצעות עיצוב תא סטנדרטי, פרוטוקולים של חומרי ניגוד מומתקים והגדרת דימות בשליטה מרחוק.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזוי, תיקוף מטרות, וצמצום העמימות המכניסטית בפנוטיפים המתווכים על ידי גזע המוח.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה, שחזוריות ויכולת הרחבה של פנוטיפיות בליעה על פני קהילות עכברים ומעבדות.
- ערך אסטרטגי: קבלת החלטות משופרת לגבי המשך או הפסקה (go/no-go), יעילות הון וצמצום סיכונים ביולוגיים בשלבים מאוחרים באמצעות זיהוי מוקדם של דיספגיה במסלולים פרה-קליניים.
- השפעה על הפורטפוליו: תיעדוף והחלטות קידום מותאמות סיכון, המבוססות על נתוני סמנים פונקציונליים מ-VFSS במודלי מחלות.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות מדעית בבדיקות נוירו-התנהגותיות, הפעלת פלואורוסקופיה וידאו וניתוח וידאו פריים-אחרי-פריים.
- הצרכים התשתיותיים והמכשיריים כוללים מערכות פלואורוסקופיה (עדיפות לאנרגיה נמוכה להדמיית עכברים ברזולוציה גבוהה), שולחנות מיקום בשליטה מרחוק ותוכנה לעריכת וידאו לצורך סקירה עיוורת.
- דרישות לסטנדרטיזציה בין צוותים כוללות התאמה של עיצוב התא, הכנת חומר ניגוד (למשל, iohexol בטעם שוקולד) וקריטריונים לבחירת פרקי שתייה בין אתרים שונים.
- שיקולי התאמה בין מערכות מודל כוללים התאמת גודל התא, טעימות חומר הניגוד ופרוטוקולי מיקום עבור זני מכרסמים שונים וחומרות מחלה משתנות.
- מגבלות מעשיות הנתמכות בחומרי המקור כוללות תלות ברמת האנרגיה של הפלואורוסקופ לצורך גילוי פרמטרים, כאשר מערכות בעלות אנרגיה גבוהה מגבילות את הכימות לשבעה פרמטרים לעומת שלושה-עשר במערכות בעלות אנרגיה נמוכה.
