פרספקטיבה טכנית במחקר העץ-טבעת מודרנית - כיצד להתגבר על Dendroecological ואתגרי אנטומי עץ

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא ליצור עץ משוכפל היטב ונפתור מאוד. ערכות נתונים אנטומיות לחקר השפעות הזמן והגורמים הסביבתיים על צמיחת עצים ושיחים. זה מושג על ידי שימוש בנוזל לא ניוטוני כדי לייצב את תאי הצמח במהלך חתך המיקרוטום, מה שמאפשר ניתוח מיקרוסקופי מפורט של הדגימות כשלב שני.

חלקי המיקרו מוכתמים כפול כדי להקל על ההתמיינות של התאים הליגניים והלא מגולגלים, ולאחר מכן נלקחות תמונות דיגיטליות של הדגימות. בסופו של דבר ניתן לבצע ניתוחים אוטומטיים מבוססי תאים של צמיחת הצמח וניתוחי סדרות זמן קשורות כדי לאפשר הערכה של הפרמטרים האנטומיים של העץ המעניינים. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו שליחת ציון הדגימה שעם הטכניקות שלנו, התאים אינם מלאים בנסורת, וכתוצאה מכך דגימות איכותיות הרבה יותר ברורות לניתוח תמונה.

יתר על כן, הוספת נוזל שאינו ניוטון לתאים במהלך החיתוך מאפשרת הימנעות מהטכניקה הגוזלת זמן של הטמעת הדגימה בפרפין. המיקרוטומים החדשים שנראה בסרטון פותחו בשילוב המעבדה שלנו של מרכז לו נטי של שאנג דאבס וציריך. הם בולטים בשל יציבות גבוהה של ההנחיה, המאפשרת חיתוך של דגימות גדולות וצפופות.

לדגימת ליבה של גבעולי עצים. התחל בהנחת ליבת תוספת מושחזת בניצב לציר הגידול של גזע העץ. לאחר מכן, סובב את הליבה והשתמש במחלץ כדי להסיר את דגימת הליבה המתקבלת מהעץ.

סמן את הליבה עם מזהה ספציפי המסומן בעיפרון רך על משטח הליבה, וחזור על ההליך בצד הנגדי של הגבעול כאשר כל הדגימות נאספו. אחסן את הליבות המסומנות במיכל מתאים כדי להגן עליהן מפני נזק במהלך ההובלה. לאחר מכן, לאחר שתחזור למעבדה, הרכיב את כיוון הסיבים של דגימות הליבה, זקוף על קורות תמיכה מעץ עם דבק עץ עמיד במים, ותן להן להתייבש לדגימת מיקרו ליבה.

ראשית, השתמש באיזמל כדי להסיר חלק מהקליפה לפי הצורך. לאחר מכן הניחו מכשיר ניקוב מיוחד בניצב לציר הגידול על הגבעול שזה עתה הדגים, והשתמשו בפטיש כדי לחדור את הקסילם של הגבעול לעומק של כשני סנטימטרים. סובב את מכשיר הניקוב כדי לשבור את ליבת המיקרו שנוצרה בתוך הכלי.

לאחר מכן הסר את הליבה מהגבעול ואחסן אותה בצינור מיקרו צנטריפוגה מסומן. כדי לחתוך משטח רגיל על דגימת ליבה, התחל על ידי קיבוע ליבת העניין הגדלה במחזיק הליבה של מיקרוטום ליבה שפותח לאחרונה לחיתוך משטחי מישור על ליבות לכל היקףן. לאחר מכן הרם את הליבה עד שהיא נוגעת מעט בלהב, המקובע על הנחיית מיסב כדורי על היקף הליבה, ומשוך את הלהב כדי לחתוך את החלק הראשון של החלק העליון של הליבה.

לאחר מכן, דחף את הסכין מאחורי הליבה. הרם את מחזיק הדגימה כ-10 מיקרון וחזור על הליך החיתוך עד כשליש מהליבה. הקוטר נחתך וכתוצאה מכך משטח רגיל רציף.

לניתוח תמונה מפורט של המבנה האנטומי של הדגימות, יש להכין קטעי מיקרו עם סוג מיקרוטום אחר. ראשית, תקן את דגימת הליבה המעניינת במחזיק המיקרוטום של המיקרוטום. לאחר מכן מקם את להב המיקרוטום בהנחיית המיסב הכדורי ומשוך את הלהב מעל הליבה.

דחוף את הלהב לאחור כדי להרים את הדגימה ב-20 עד 30 מיקרון. לאחר מכן משוך את הלהב מעל הדגימה. שוב, חוזרים על תהליך זה עד שנוצר משטח רציף בחלק העליון של הדגימה.

כעת בעזרת מברשת צבע, מכסים את המשטח המתקבל בתמיסת עמילן תירס. לאחר מכן הרם את הדגימה ב-15 מיקרון והנח את המברשת על פני הדגימה. משוך את הלהבים לאט לכיוון הדגימה, התחל חיתוך דק מתחת למברשת והשתמש במברשת כדי להנחות את החלק על פני הלהב כאשר החלק כולו נחתך.

השתמש במברשת נוספת ובמים כדי להסיר את הרקמה מהלהב ולהניח אותה על מגלשת זכוכית כדי לאפשר הבחנה בין המבנים הליגניים והלא מגולגלים. שוטפים את הגליצרול במים בעזרת פיפטה. לאחר מכן, מכסים את החלק הרטוב בכמה טיפות של תערובת זעפרן פנימה וכחול אסטרו.

לאחר חמש דקות יש לשטוף את הצבעים במים ולאחר מכן לייבש מיד את החלק בטיפולי אתנול רצופים. לאחר הטיפול באתנול מיובש, יש לשטוף את החלק שוב ושוב ב-100% xol. ברגע שהסול נשאר צלול.

מכסים את הטישו בטיפה של 100% בלסם קנדה וכוס כיסוי תוך הקפדה על הימנעות מבועות אוויר. לאחר מכן הניחו את שקופית המיקרו שהתקבלה בין שתי רצועות פלסטיק עמיד בחום והניחו אותה על צלחת מתכת. הניחו משקולת על גבי השקופית כדי לשמור על החלק שטוח, ולאחר מכן הכניסו את השקופית לתנור של 60 מעלות צלזיוס.

לאחר 12 שעות, הניחו לשקופית להתקרר לטמפרטורת החדר, ולאחר מכן הסירו את המשקל ורצועת הפלסטיק. לבסוף, נקו את המגלשה באמצעות סכיני גילוח כדי להסיר עודפי בלסם על ידי ביצוע הליכי החיתוך והצביעה שהוצגו לפני שניתן להכין כל מיני דגימות בגדלים וצורות שונות, גם על ידי שימוש במחזיקים מיוחדים כמובן ליצירת תמונות דיגיטליות של משטחי הליבה לניתוח כלי דם. ראשית, חתוך את מישור פני השטח של הליבה עם מיקרוטום הליבה כפי שהודגם זה עתה, והשתמש בטוש לבד כדי להכתים את פני השטח המתקבלים בשחור.

ברגע שהצבע מתייבש, יש לשפשף את משטח הליבה בגיר לבן ואז ללחוץ את הגיר לתאים בעזרת אצבע. הסר את כל הגיר העודף, ולאחר מכן הנח את הליבה על הבמה של מיקרוסקופ דו-עיני המצויד במצלמה דיגיטלית המתחילה בצד אחד של הליבה. כעת רכשו רצף של תמונות חופפות מעט עד שכל המשטח נלכד.

לאחר מכן תפר את התמונות הבודדות יחד כדי ליצור תמונה שלמה של משטח הליבה ליצירת תמונות דיגיטליות משקופיות המיקרו. הנח את השקופית על במת המיקרוסקופ ובחר את ההגדלה המתאימה למבנים שיש לנתח. לבסוף, רכשו תמונות חופפות של החלקים המותקנים על שקופיות המיקרו המנוקות כפי שהודגם זה עתה עבור דגימת משטח הליבה ותפרו את התמונות יחד ליצירת תמונה אחת שלמה של הקטע.

היכולת להחזיק תאים פתוחים היא צעד חשוב ראשון לקראת התאמה של מבנים אקולוגיים אנטומיים של דנדרו לניתוח סדרות זמן. לניתוח מפורט יותר של עץ מוקדם או קנה עץ מאוחר בעצי מחט, יש צורך כאן בקטעי מיקרו באיכות גבוהה. יש להימנע מחפצים פוטנציאליים כגון דפנות תאים שבורים.

מריחת נוזל לא ניוטוני על הדגימה, כמו תמיסת עמילן התירס כפי שהודגם זה עתה תומכת ביציבות מבנה התא. מדורי מיקרו מאפשרים קביעה בטוחה יותר של דרגות שנתיות. זה נכון במיוחד עבור עצי מחט הגדלים על גבולותיהם הטבעיים.

כפי שניתן לראות כאן, טבעות צרות במיוחד הן שכיחות אך קשות לזיהוי מקרוסקופי. במקרים קיצוניים, הטבעות מורכבות משורת תאים אחת או שתיים, שעשויות להיות גלויות רק בעת שימוש במיקרו קטעי מיקרו. בעת ניתוח תמונות בהגדלות גבוהות, תאים בודדים נראים לעין.

תוכנת ניתוח חצי אוטומטית מאפשרת לקבוע את השינויים בפרמטרים בודדים כגון עובי דופן התא עבור כל הטבעות הנראות בתמונה, מה שמעיד על הצורך בניתוח סדרות זמן מורחבות. צביעה כפולה של קטעי המיקרו מאפשרת הדמיה של שלבי הליגניזציה השונים. לאחר מכן ניתן לקשר מידע זה לנתונים הסביבתיים של תקופת הצמחייה המתאימה כדי לקבוע קשר צמיחה אקלימי מפורט יותר לאחר התפתחותו.

טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום האקולוגיה של DRO לחקור את הפרמטרים האנטומיים השונים של עצים ושיחים. שימוש בשיטה זו מקצר באופן דרסטי את הזמן הדרוש להפקת קטעים גדולים ואיכותיים. יש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון עבודה מתחת למכסה אדים ולבישת כפפות בעת ביצוע הליך זה.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד ליצור משוכפל היטב ונחוש מאוד לשים מערכי נתונים אנטומיים לתמיכה בניתוח סדרות זמן.