הקמתו של ארגון Human אפיתל Enteroids וColonoids מרקמות שלמות וביופסיה
6 במרץ 2015
אנו מתארים שיטה להקמת אנטרואידים אנושיים מקריפטות מעי דק וקולונואידים מקריפטות המעי הגס שנאספו הן מרקמות כירורגיות והן מביופסיות. במאמר מתודולוגי זה, אנו מציגים את אופני התרבות החיוניים לצמיחה ותחזוקה מוצלחת של אנטרואידים וקולונואידים אנושיים.
המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור כניסות אנושיות מרקמות המעי. זה מושג על ידי ניתוח תחילה של רירית המעי מהרקמה התת-רירית הבסיסית. השלב השני הוא דגירה של הרירית באמצעות EDTA כדי לקדם את ניתוק האפיתל מרקמת החיבור.
לאחר מכן, קריפטות המעיים מופרדות מהאפיתל המנותק. לבסוף, קריפטות המעי מתורבתות במטריצת קרום המרתף. בסופו של דבר, טכניקות אימונוהיסטוכימיה משמשות להצגת ארגון האפיתל כמו גם סמני אפיתל ספציפיים של ה-OIDs המתורבתים.
ההשלכות של שיטה זו היא העובדה שאנו יכולים כעת לייצר OIDs מביופסיות ספציפיות לחולה, מה שאומר שכעת אנו יכולים להשתמש ברקמה זו במעבדה כדי לבחון מחלות מעיים ואבחונים, מה שעד כה מעולם לא הצלחנו לעשות. לאחר הכנת המאגרים והריאגנטים, על פי פרוטוקול הטקסט, יש להפשיר את קרום הבסיס על קרח ולדגור מראש צלחת של 24 בארות בחממת פחמן דו חמצני בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כאשר הרקמה התקבלה. השתמש ב-PBS של KO ללא סידן ומגנזיום או DPBS כדי לשטוף את הרקמה עד שה-DPBS נקי.
מניחים את הרקמה בצלחת פטרי זכוכית מצופה סיליקון מלאה ב-DPBS קר כקרח כשהצד הרירי פונה כלפי מעלה ועם סיכות מינוצ'ין מאבטחות את הרקמה על ידי מתיחה והצמדה. לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ מנתח, השתמש במספריים מיקרו-מנתחים ומלקחיים מעוקלים עדינים כדי להסיר את הרירית הבסיסית מהתת-רירית ורקמת החיבור. לאחר מכן, כשהצד הרירי פונה כלפי מעלה, מותחים ומצמידים את הרירית המנותחת שטוחה על צלחת פטרי הזכוכית המצופה סיליקון.
בעזרת מלקחיים מעוקלים מגרדים בעדינות את פני הרירית. שלב זה הכרחי לשיפור איכות ההכנה. מכסים את הרירית במאגר כלציה EDTA של שני מילימולרים טריים.
לאחר מכן לאחר שטיפת הרקמה על קרח, שלוש עד ארבע פעמים על פי פרוטוקול הטקסט תחת מיקרוסקופ ניתוח, השתמש במלקחיים מעוקלים כדי לגרד בעדינות את הרירית כדי לשחרר קריפטות מעיים בעזרת פיפטה. הסר בעדינות את מתלה הקריפטה מצלחת הפטרי והעביר אותו לצינור חרוטי של 50 מיליליטר. לאחר מכן בדוק את הרקמה כדי לוודא שכמעט כל הקריפטות הוסרו מהרירית.
סנן את מתלה הקריפטה דרך מסנן של 150 מיקרומטר פעמיים והשתמש במיקרוסקופ כדי לבדוק את הזרימה לאחר שטיפת מתלה הקריפטה והעברת מספר הקריפטות הדרושות לצינור תחתון עגול של חמישה מיליליטר, על פי פרוטוקול הטקסט, צנטריפוגה את שבר הקריפטה למשך 10 דקות ב-150 Gs וארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן הסר את הסופרנטנט באמצעות קצות פיפטה מקוררים מראש ומטריצת קרום המרתף השעיה. כדור הקריפטה.
החל 50 מיקרוליטר של מתלי קריפטה במטריצת קרום הבסיס לכל באר על הצלחת החמה מראש על ידי פליטה איטית של מטריצת קרום הבסיס במרכז הבאר. דגרו את הצלחת בחממת פחמן דו חמצני של 37 מעלות צלזיוס 5% למשך 30 דקות כדי לאפשר פילמור מלא של מטריצת קרום המרתף. לאחר מכן כיסו את מטריצת קרום המרתף ב-500 מיקרוליטר של מדיום מיני מעיים אנושי שלם, בתוספת 2.5 מיקרומולר כל אחד מ-CHIR 9 0 2 2 1.
ותיין דוגר על הרקמה ומחליף את המדיום לאחר יומיים, ואז כל יומיים לאחר מכן. איור זה מציג דוגמה טיפוסית לקריפטות שבודדו לאחרונה מרקמה שלמה. מספר הקריפטות המבודדות מביופסיה קטן יותר מאשר ברקמה שלמה.
שתי עקיצות ביופסיה מבוצעות בדרך כלל במעבר אחד. כל עקיצת ביופסיה מביאה למשטח של 10 מילימטר רבוע עם ממוצע של 50 עד 100 קריפים לביופסיה. לאחר תרבית ומטריצת קרום הבסיס במשך חמישה עד שישה ימים, הקריפס מתעגלים ליצירת כדורי אנטרו למעי הדק וכדורי המעי הגס למעי הגס ועוברים לאחר שבעה ימים.
הכניסות או ה-OIDs שנקבעו מביופסיות המוצגות כאן עוברות את אותה התפתחות בצפיפות נמוכה יותר בזריעה. לכן, האריזה נעשית בדרך כלל לאחר 10 עד 12 יום בתרבית. כפי שמוצג כאן, גם OIDs וגם OIDs מציגים צד לומינלי ומרופדים באפיתל.
ניתן לצפות בתאים מתרבים בתוך ה-OIDs והם ממוקמים בתוך קצות הניצנים. הדמיה קונפוקלית של OIDs מוכתמים ב-e catrin כאן בירוק מראה את תאי האפיתל. איור זה מראה כניסות שגדלות מחולה עם סיסטיק פיברוזיס ואנטרופתיה ציצית עקב מוטציה מולדת בגן מולקולת ההידבקות של תאי האפיתל.
ניתן להשתמש בהליך זה או בשיטה כמו PCR בזמן אמת או דם מערבי כדי לענות על שאלות נוספות בנוגע לגן או בדיקה מעניינת. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד באופן עקבי קריפס אנושי כדי שתוכל ליצור ביעילות כניסות במעבדה שלך כדי לענות על שאלות ספציפיות למטופל שלך.
סקירה כללית
מאמר זה מתאר שיטה להקמת אנטרואידים אנושיים מקריפטות של המעי הדק וקולונואידים מקריפטות של המעי הגס. הפרוטוקול מפרט את אופני התרבית החיוניים לצמיחה ולתחזוקה מוצלחת של אורגנואידים אלו.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- גסטרואנטרולוגיה
רקע
- אנטרואידים וקולוניאידים אנושיים מופקים מרקמות מעי.
- השיטה מאפשרת מחקרים של מחלות מעי המותאמים למטופל ספציפי.
- בטכניקות קודמות חסרה היכולת לנצל ביופסיות של מטופלים באופן יעיל.
- אימונוהיסטוכימיה משמשת לניתוח הארגון האפיתליאלי.
מטרת המחקר
- ליצירת אורגנואידים אנושיים מרקמות מעי.
- לקידום המחקר על מחלות מעי ואבחון רפואי.
- לשיפור ההבנה של התנהגות תאים אפיתליאליים בתרבית.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הפרדה של הרירית המעיית מהרקמה התת-רירית.
- אינקובציה עם EDTA לצורך דיסוציאציה של התאים האפיтелиאליים.
- תרבית של קריפטות מעי בתוך מטריקס של קרום הבסיס.
- שימוש בדימות קונפוקלי ובאימונוהיסטוכימיה לצורך אנליזה.
תוצאות עיקריות
- בידוד מוצלח של קריפטות מעי מביופסיות.
- יצירת אורגנואידים המדמים את מבנה המעי.
- תצפית על תאים פרוליפרטיביים בתוך אורגנואידים.
- הדגמה של פיתוח אורגנואידים ספציפיים לחולה.
מסקנות
- השיטה מאפשרת יצירה יעילה של אנטרואידים אנושיים.
- היא פותחת נתיבים לחקר מצבים מעיים ספציפיים למטופל.
- יישומים עתידיים כוללים ניתוח ביטוי גנים ומידול של מחלות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מודלים של אנטרואידים וקולוניאידים אנושיים מספקים מערכת רלוונטית פיזיולוגית לחקר הביולוגיה של אפיתל המעי ומנגנוני מחלה. גישה זו מאפשרת מידול מחלות ספציפי למטופל, ובכך תומכת בתיקוף מטרות (target validation) והפחתת סיכונים בשלבים הפרה-קליניים בתוכניות לגילוי תרופות המתמקדות בגסטרואנטרולוגיה. השיטה מגשרת בין ביולוגיה של גילוי למחקר תרגומי באמצעות יצירת מודלים של רקמות ממקור אנושי, הניתנים לשכפול ולהרחבה.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות תאי אפיתל של המעי המופקים ממטופלים, השומרים על הגמישות התאית המקורית ועל הפולריות.
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף תפקודי של מטרות על ידי מידול פנוטיפים אפיתליים רלוונטיים למחלה מחומר ביופסיה.
- ערך תרגומי: מגביר את הביטחון החזוי על ידי שימור רקעים גנטיים ספציפיים למטופל במערכת תרבית תלת-ממדית (3D) ניתנת להרחבה.
סקר ופיתוח בדיקה (Assay)
- מוכנות הבדיקה: מייצרת שכבות מונואלית אפיתליאליות וספרואידים סטנדרטיים המתאימים לתהליכי דימוי בתוכן גבוה (high-content imaging) וסריקת תרכובות.
- פלט כמותי: מאפשרת מדידה של ארגון אפיתליאלי, פרוליפרציה ודיפרנציאציה באמצעות אימונוהיסטוכימיה ודימוי קונפוקאלי.
- שחזוריות: קובעת תנאי בידוד וטיפוח עקביים של קריפטות, שהם קריטיים לסטנדרטיזציה של הבדיקה בין מעבדות שונות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מידול מחלות: מקל על חקר מצבים מעיים ספציפיים למטופלים, כגון סיסטיק פיברוזיס ו-tufting enteropathy, באמצעות אורגנואידים המופקים מביופסיה.
- המשכיות פרה-קלינית: תומך במעבר משלב הגילוי לתיקוף פרה-קליני על ידי שמירה על מבנה האפיתל ופעילות תאי הגזע לאורך זמן.
- סנכרון עם סממנים ביולוגיים: מאפשר ביסוס קורלציה בין פנוטיפים של אורגנואידים לבין סממנים ביולוגיים קליניים לצורך קבלת החלטות על קידום מותאם סיכון.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
השיטה משתלבת ברצף הגילוי על ידי אספקת מודלים של אפיתל אנושי למחקרי מעורבות מטרה (target engagement), בדיקות של מושגלי מסלולים ובדיקות רעילות לפני אופטימיזציית המועמד המוביל.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות ובבירור מסלולים ביולוגיים באמצעות מניפולציה מבוקרת של אפיתל מעי המופק מחולים.
- סריקה: מספק תוצאים כמותיים וניתנים לשחזור לסריקת תרכובות באמצעות זריעה סטנדרטית של קריפטות והטמעה במטריצה.
- אנליטיקה: מספק תוצאים מבוססי דימיון (למשל, קוטביות אפיתליאלית, סממני התרבות) המאפשרים ניתוח השוואתי בין תנאים גנטיים או תנאי טיפול.
- מחקר תרגומי: מקשר לעבודה פרה-קלינית על ידי שימור מוטציות ספציפיות למטופל ופנוטיפים אפיתליאליים הרלוונטיים להפרעות במערכת העיכול.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה מתחדשת לשימוש במספר פרויקטים לצורך תיקוף מטרות, מחקרי מנגנון פעולה ואפיון בטיחות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזויי בתיקוף המטרה באמצעות מודלים של אפיתל אנושי רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית.
- ערך תפעולי: פרוטוקולים סטנדרטיים של דיסוציאציה ותרבית מבטיחים הדירות בין אתרים ומבצעים שונים.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות לגבי המשך הפיתוח (go/no-go) על ידי הפחתת אי-ודאות ביולוגית בהערכה פריקלינית מוקדמת.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של תרכובות מותאם-סיכון על בסיס יעילות ורעילות במערכות מעי ממקור אנושי.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בדיסקציה של רקמות, בידוד קריפטות וטכניקות של תרבית בתלת-ממד להפקה מוצלחת של אורגנואידים.
- גישה למטריצת קרומי בסיס, מצעי תרבית מוגדרים ואינקובטורים עם בקרת CO2 חיונית ליצירה עקבית של אורגנואידים.
- סטנדרטיזציה של עיבוד הביופסיה וכמות הקריפטות נחוצה לשיתוף פעולה רב-תחומי ולהשוואתיות של הנתונים.
- התאמה לאזורים שונים של המעי (למשל, אילאום לעומת מעי הגס) דורשת אופטימיזציה של תנאי הדיסוציאציה והתרבית.
- תחזוקה לטווח ארוך מחייבת מעברים (passaging) והחלפות מצע קבועות כדי למנוע אובדן דיפרנציאציה וצמיחת יתר.
