ההערכה הניסויית של עכבר חברותי בגישת עיבוד תמונה אוטומטית
15 במאי 2016
פרוטוקול זה מתאר שיטה לכמת חברותיות עכבר. עכברים הם צילמו כאשר הם עוברים ולתקשר בכלוב מיוחד. עיבוד סרט מאפשר כימות האוטומטיות של חברותיות עם דיוק ואמינות מעולים.
המטרה הכוללת של ניסויים התנהגותיים אלה בשילוב עם ניתוח אוטומטי היא לכמת את החברותיות של עכברים בצורה יעילה בזמן. שיטה זו יכולה לסייע בסינון מהיר של תרופות כדי להגביר את החברותיות במודלים עכבריים מאומתים של הפרעות על הספקטרום האוטיסטי. היתרון העיקרי בהכנסת ניתוח אוטומטי הוא בכך שהוא מאיץ את התהליך והופך את הסינון ליעיל יותר.
הצורך בשיטה אוטומטית להערכת התנהגות חברתית של עכברים התעורר מכיוון שסינון חזותי בזמן אמת של מנה בודדת של תרכובת מועמדת לוקח יותר מ-50 שעות. בהמשך הסרטון תדגים הסטודנטית שלי לתואר שני פרנסי ורגזה את הניתוח האוטומטי. התחל בהגדרת הכלוב בעל שלושת התאים עם הקירות השחורים.
בפגישה הראשונה הניחו תיל הפוכה ריקה בכל תא קצה של הכלוב. כעת הכינו את מצלמת הווידיאו לצפייה בכלוב מלמעלה. יש לראות את כל שלושת התאים ברזולוציה של לפחות 720 על 480 פיקסלים.
לאחר מכן האירו את הכלוב בתאורת ליבון עקיפה כך שפנים הכלוב, כאשר נמדד מהרצפה, לא יהיה יותר מ -3.5 לוקס. ספק גם אור אינפרא אדום כדי להאיר את הכלוב ברמה שהמצלמה יכולה לזהות. צלם תמונה של מסגרת אחת של הכלוב הריק לעיון.
בפגישה הראשונה הנח את עכבר הבדיקה בכלוב. ואז כדי לתור את הניתוח האוטומטי של הווידאו, נופף יד מעל הכלוב רק פעם אחת. תן לעכבר לחקור את כלוב הבדיקה במשך 10 דקות.
לאחר מכן החזירו אותו לכלוב הביתי שלו. בפגישה השנייה הניחו את עכבר הגירוי מתחת לאחת משתי הכוסות ההפוכות. בחר איזו בצורה מאוזנת.
בתוכנה ציין מתחת לאיזו הונח עכבר הגירוי. עבור מוסכמות שמות, הכוס המכילה את העכבר הסגור היא הכוס החברתית ואילו הכוס השנייה היא הכוס הלא-חברתית. התאים נקראים באופן דומה.
הצב בתור את תחילת ההפעלה השנייה בהינף יד כמו בהפעלה הראשונה. בתום הפגישה השנייה יש להסיר את הכוסות ההפוכות כדי לשחרר את העכבר השני. השתמש בנפנוף יד נוסף כדי לציין את תחילת הפגישה השלישית ותן לשני העכברים לקיים אינטראקציה בכלוב הבדיקה למשך 10 דקות.
לאחר 10 דקות החזירו את שני העכברים לכלובי הבית שלהם. סעיף זה מסביר כיצד לעבד את הסרטים באמצעות ממשק המשתמש. עם זאת, ניתוח מהיר של מצב אצווה ללא קלט משתמש אפשרי גם כן.
התחל בטעינת הסרט באמצעות כפתור הטעינה. לאחר מכן בחר את תצורת הכלוב. תוכנת האנליזה מאתרת את גבולות הכלוב, התאים והכוסות.
בחר אחת מארבע התצורות המוגדרות מראש או התאם ידנית את הקואורדינטות. כעת, עבור כל פריים של הסרט, בצע את שלבי העיבוד הבאים. ראשית המירו את המסגרות לגווני אפור.
שנית, הפחיתו את מסגרת הייחוס בגווני אפור שנעשתה במהלך ההכנות, ובכך אפסו את ערכי הפיקסלים בכל מקום מלבד מיקום העכבר. שלישית, הפוך את המסגרות לבינאריות על ידי הגדרת כל הפיקסלים מעל בהירות סף ללבן והפיכת כל השאר לשחורים. התאימו הגדרה זו כך שתתאים לתנאי התאורה.
כעת הסר את הזנב מהתמונות באמצעות פונקציית Erode/Dilate. ראשית שחק את התמונה הבינארית שלוש פעמים. לאחר מכן הרחב את המסגרת שש פעמים.
לאחר מכן שחק את המסגרות שלוש פעמים נוספות. פעולה זו עשויה לדרוש התאמה אם נעשה שימוש ברזולוציית פיקסלים שונה. גלי הידיים מזוהים בקלות כקפיצות ענק בנפח הפיקסלים הלבנים.
זה מאפשר זיהוי אוטומטי של התחלות הפעלה וסדר הפעלות. בכל הפעלה זהה את הרכיב הגדול ביותר של פיקסלים לבנים באמצעות הפקודה L/Comp. פעולה זו מבטלת את הפיקסלים שאינם שייכים לעכבר.
לאחר מכן השתמש בפונקציה Find Ends כדי לקבוע את שני הפיקסלים הרחוקים ביותר בתוך הרכיב הגדול ביותר של פיקסלים לבנים. אלה הם האף והזנב. התוכנה קובעת את מרכז הכובד או COG עבור אובייקט הפיקסל הלבן ומחשבת את כיוון התנועה שלו ממסגרת למסגרת.
עבור הפעלות עם שני עכברים יש לעקוב אחר שני אובייקטים. בחר וכיוון את שני האובייקטים הלבנים הגדולים ביותר באמצעות אותה ערכת פקודות. התוכנה בודקת אוטומטית את ה-COG ממסגרת למסגרת.
אם אחד האובייקטים משתנה בגודלו ביותר מ-20% או ש-COG זז רחוק יותר מהאפשרי עבור עכבר, סף הבינאריזציה גדל אוטומטית עד לעמידה בקריטריונים אלה. התוכנה בודקת אוטומטית את מרכזי הכובד ממסגרת למסגרת. אם אחד האובייקטים משתנה בגודלו ביותר מ-20% או שמרכז הכובד זז רחוק יותר מהאפשרי עבור עכבר, סף הבינאריזציה מותאם אוטומטית עד לעמידה בקריטריונים אלה.
אינטראקציות מזוהות באופן אוטומטי כאשר האובייקטים נמצאים בטווח של שני סנטימטרים. מקטעים אלה מושמעים לקלט המשתמש. עבור כל קטע תייגו את נקודת המבט של עכבר המבחן כהימנעות חברתית, גישה חברתית או אף אחד מהם.
כדי לאמת את הניתוח האוטומטי, טען את הסרט באמצעות לחצן טען. לאחר מכן לחץ על התחל מפגש 1 כדי להציג את המסגרת הראשונה של אותו מפגש. השתמש בפקודה הפעל/עצור כדי לשלוט בהפעלה.
הסרטים המעובדים מראים כל עכבר עם עיגול בצבע שונה בראשו ובזנבו. כמו כן, מדדי החברותיות מוצגים על המסך ומתעדכנים במהלך ההפעלה. תקן את כל השגיאות שנתקלו בהן בניתוח האוטומטי.
השגיאה הנפוצה ביותר היא היפוך זנב ראש שניתן לתקן באמצעות כלי בממשק. זה קורה בכ-20% מהסרטונים. במקרה הנדיר של שגיאה מסובכת יותר ניתן לפתור אותן בדרך כלל על ידי ציון ידני של מיקום האף של העכבר על פני סדרה מסוימת של פריימים וידאו.
לאחר האימות, ייצא את נתוני החברותיות בפורמט גיליון אלקטרוני באמצעות הפונקציה Export. כדי לייצא נתונים מסרטים מרובים כגיליון אלקטרוני יחיד, יש לאגד את הסרטים בתיקיה אחת, והפונקציה 'הידור נתונים' מבצעת את הפעולה. במפגש הראשון עקבו אחר עכבר מבחן BALB/c בן ארבעה שבועות כשהוא נע בין תאים 59 פעמים במשך 10 דקות.
זמן השהות בכל תא נחשב לקו בסיס להעדפת תאים ללא גירוי חברתי. במפגש השני הוצגה גביעונית חברתית ולא חברתית עם עכבר ICR נסתר בן ארבעה שבועות. הייתה הטיה ברורה לבילוי זמן בתא החברתי.
באופן ספציפי, העכבר בילה יותר זמן עם הכוס החברתית מאשר עם הכוס הלא חברתית. בפגישה השלישית הגביעוניות הורמו והעכברים הורשו לקיים אינטראקציה. בסך הכל נעשו 35 פניות חברתיות במשך 10 דקות.
לאחר פיתוחה, טכניקה זו מאפשרת סינון מהיר יותר של תרופות מבטיחות כדי לשפר את תחום הסימפטומים המרכזי של פגיעה בחברותיות במודלים עכבריים מאומתים של הפרעות על הספקטרום האוטיסטי. ניתן להתאים את העיבוד האוטומטי לעיצובים ומינים שונים של כלובים. ניתן להעריך כל התנהגות מעניינת כל עוד ניתן לפתח אלגוריתם שיזהה אותה באופן מהימן.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר שיטה לכימות חברתיות בעכברים באמצעות ניתוח אוטומטי של הקלטות וידאו. גישה זו משפרת את היעילות של סריקת חברתיות במודלים של עכברים להפרעות בספקטרום האוטיסטי.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- ניתוח התנהגותי
- מחקר על אוטיזם
רקע
- הערכת החברתיות של עכברים היא קריטית להבנת התנהגויות חברתיות.
- שיטות מסורתיות הן גוזלות זמן ודורשות עבודה רבה.
- ניתוח אוטומטי יכול להפחית משמעותית את הזמן הנדרש להערכות חברתיות.
- שיטה זו רלוונטית במיוחד לסריקת תרופות במחקרי אוטיזם.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה יעילה מבחינת זמן לכימות חברתיות בעכברים.
- סיוע בסריקה מהירה של תרכובות שעשויות להגביר חברתיות.
- שיפור הדיוק והמהימנות של הערכות חברתיות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- צילום וידאו של עכברים בכלוב תלת-תאים שתוכנן במיוחד.
- עיבוד אוטומטי של נתוני וידאו לצורך כימות חברותיות.
- השוואת תוצאות מול שיטות סינון חזותיות מסורתיות.
- הדגמה של תהליך הניתוח האוטומטי.
תוצאות עיקריות
- השיטה האוטומטית מספקת מדידות חברתיות מדויקות ואמינות.
- מפחיתה באופן משמעותי את הזמן הדרוש להערכות חברתיות.
- מאפשרת סריקה יעילה של תרופות במודלים של עכברים.
- הוכחה כיעילה במערך ניסויי ממשי.
מסקנות
- ניתוח אוטומטי הוא כלי בעל ערך להערכת חברותיות בעכברים.
- שיטה זו יכולה להאיץ מחקרים על הפרעות בספקטרום האוטיסטי.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על גישה זו לצורך חקירות התנהגותיות נוספות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
כימות אוטומטי של חברותיות בעכברים מאפשר סריקה מהירה של תרכובות המכוונות לליקויי התנהגות חברתית במודלים מאושרים של הפרעות בספקטרום האוטיסטי. על ידי צמצום זמן ההערכה מיותר מ-50 שעות למנה לעיבוד יעיל של קבוצות (batches), שיטה זו תומכת בתיקוף מטרות ובזיהוי מובילים (lead identification) בתפוקה גבוהה. היא מספקת מדדי התנהגות כמותיים וניתנים לשחזור, המשפרים את הביטחון החזוי בהחלטות בשלבי הגילוי המוקדמים.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מכמת את החברתיות באמצעות הזמן שהושקע בקרבת גירויים חברתיים לעומת גירויים לא-חברתיים ומספר פעמים של גישה חברתית, מה שמאפשר בחינה מכניסטית של היפותזות טיפוליות.
- ערך תפעולי: מעקב אוטומטי אחר האף וניתוח תנועה מבטלים את הצורך בדירוג ידני, ובכך מגבירים את התפוקה ומפחיתים שונות בין צופים.
- ערך חיזוי: מייצר מדדי חברתיות התגובים למינון, התומכים בהפחתת סיכונים של מטרות טיפוליות ובסינון תיקי פיתוח בגילוי תרופות למערכת העצבים המרכזית (CNS).
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: מי apparatus סטנדרטי בעל שלושה תאים עם ניתוח וידאו אוטומטי יוצר פלטפורמה הניתנת לשחזור להערכת חברתיות.
- תוצרים כמותיים: מודד מעברים בין תאים, זמן באזור החברתי ואירועי גישה/הימנעות חברתית כמשתנים רציפים לסריקת תרכובות.
- יכולת הרחבה (Scalability): יכולת עיבוד במנות מאפשרת הערכה של מספר תרכובות במקביל, ובכך תומכת בתהליך ה-hit-to-lead.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מדמה באופן ישיר פגיעה בכישורי חברה, תחום סימפטומים מרכזי בהפרעות הספקטרום האוטיסטי, מה שמאפשר התאמה של סממנים ביולוגיים תרגומיים.
- המשכיות פרה-קלינית: תומך בהערכה אורכית של שינויים בכישורי חברה לאורך משטרי טיפול במודלים מאושרים של עכברים.
- החלטות מותאמות סיכון: נתונים אובייקטיביים על כישורי חברה מסייעים בקבלת החלטות לגבי המשך או הפסקת הניסוי (go/no-go) על ידי הפחתת העמימות המכניסטית בפנוטיפים התנהגותיים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
שיטה זו משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת היפותזות על מטרות, דרך זיהוי תרכובות מובילות ועד להערכת יעילות פרה-קלינית, ומספקת את המדד של חברות (sociability) כנקודת קצה כמותית עבור תרכובות המשפיעות על התנהגות חברתית.
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת הערכה מבוססת היפותזה של מנגנוני חברתיות על ידי כימות העדפה לאינטראקציה חברתית והתנהגויות גישה.
- סריקה: מספקת ציוני חברתיות סטנדרטיים ואוטומטיים התומכים בחזרתיות של הבדיקה ובהשוואת תרכובות בין לוחיות ובין ימים.
- אנליטיקה: מייצרת מדדי חברתיות מספריים (זמן, מעברים, ספירות גישה) המקלים על ניתוח סטטיסטי ומידול של קשר מבנה-פעילות.
- מחקר תרגומי: מקשר לרלוונטיות קלינית על ידי מידול תחום אבחוני מרכזי של אוטיזם, ובכך תומך בתיקוף פרה-קליני המותאם לסממנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר בארגון: זרימת עבודה אוטומטית המסתגלת לתכנוני כלובים ומינים שונים, מה שמאפשר יישום חוצה-תוכניות בפרמקולוגיה התנהגותית.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מספק מדדים כמותיים ואובייקטיביים של חברתיות (sociability), המפחיתים סובייקטיביות ומגבירים את הביטחון במעורבות המטרה (target engagement).
- ערך תפעולי: אוטומציה מקצצת את זמן העבודה הידנית לכל בדיקה משעות לדקות, ובכך מאפשרת מסעות סריקה בעלת תפוקה גבוהה (high-throughput screening).
- ערך אסטרטגי: מאיצה את אופטימיזציית המולקולות המובילות (lead optimization) באמצעות אספקת משוב מהיר על חברתיות, מה שמשפר את יעילות ההון בתוכניות מחקר של מערכת העצבים המרכזית (CNS).
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשרת תיעדוף של תרכובות מותאם-סיכון, בהתבסס על פרופילי חברתיות חסונים במודלים רלוונטיים למחלה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במדעי המוח ההתנהגותיים ובאלגוריתמים של מעקב וידאו לצורך הגדרה ותיקוף.
- דורש תאורה סטנדרטית, יכולת אינפרא-אדום ומצלמה ברזולוציה מינימלית של 720x480 לזיהוי אמינות של האף.
- מחייב תזמון עקבי של הסשנים ומיקום מאוזן (counterbalanced) של הגירויים כדי למנוע הטיות מיקומיות.
- כולל אימות ידני של כיוון הראש-זנב בכ-20% מהסרטונים כדי לתקן שגיאות מעקב אוטומטיות.
- תלוי בכיוונון סף הבינריזציה כדי לשמור על דיוק המעקב בתנאי תאורה ובזני עכברים שונים.
