הערכה תפקודית ומורפולוגי של סרעפת עצבוב על ידי סרעפת מנוע נוירונים

המטרה הכוללת של הליך זה היא להעריך כמותית את העצבוב התפקודי והמורפולוגי של הסרעפת על ידי נוירונים מוטוריים פרניים של חוט השדרה הצווארי. זה מושג על ידי ביצוע רישום פוטנציאל פעולת שרירים מורכבת מסרעפת ההמי בבעלי חיים מורדמים לאחר גירוי סופר מקסימלי של העצב הפרני המקביל. השלב הבא הוא לבצע אימונוהיסטוכימיה של דיאפרגמה שלמה כדי להעריך מורפולוגית את העצבוב של צמתים עצביים-שריריים בודדים.

בסופו של דבר, שילוב של פוטנציאל פעולת שרירים מורכב וניתוחי צומת עצביים-שריריים מספק גישה רבת עוצמה למחקר כמותי של עצבוב סרעפתי במודלים של מכרסמים של מחלת CNS ו-PNS. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום פגיעות חוט השדרה, כגון האם ניתן להשתמש בהתערבויות טיפוליות כדי להצליח לשחזר את התפקוד הסרעפתי? ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול במחלות כמו פגיעה טראומטית בחוט השדרה ו-ILS מכיוון שתפקוד הנשימה הסרעפתי ממלא תפקיד מפתח בתוצאות המטופל בשני המצבים המתישים הללו, מדגימה את ההליך ד"ר קאלי, פוסט-דוקטורנטית במעבדה שלי, מלאני מרטין, סטודנטית לתואר ראשון במעבדה של ד"ר רייט, ותמרה הולה, טכנאית מחקר במעבדה שלי.

לאחר הרדמת החיה, הנח אותה על לוח הניתוחים, הצד הגבי כלפי מטה והדק את הגפיים הקדמיות ללוח. לאחר מכן גלח את משטח הגחון מבסיס הגולגולת לכיוון הבטן משני צידי קו האמצע. לאחר ניקוי העור, מקם את האלקטרודות המחברות את הקרקע לזנב והנח את אלקטרודת הייחוס לתוך הבטן התחתונה הנגדית תת עורית.

יש להכין את אלקטרודת ההקלטה עם ג'ל מוליך על החלק הדביק ולאחר מכן לחבר אותה לאורך שולי החוף החד-צדדיים. כעת הניחו את האלקטרודות המעוררות, דרך העור במרחק של חצי סנטימטר זו מזו, לרוחב קנה הנשימה ועדיפות על עצם הבריח. הם צריכים להיכנס בניצב לעור וללכת לעומק של סנטימטר אחד.

אלקטרודות אלה חייבות להיות מאובטחות היטב, ועדיף לעשות זאת ביד. חבר את כל האלקטרודות לממריצים ולמגברים המתאימים להן. יש לרשום את הנתונים שנאספו במחשב.

לניתוח, הגדר את פרמטרי הגירוי של גירוי הקוטב היחיד ל-0.5 אלפיות השנייה, פולסים סופר מקסימליים של הרץ אחד. משרעת יכולה לנוע בין שישה לשמונה וולט. הגדר את זמן גירוי העניין ל-30 שניות, וממוצע התגובה מ-10 גירויים רצופים תוך שימוש בקו הבסיס לשיא המשרעת מכל בעל חיים בערך פעם בשבוע אם תרצה.

הטיפול בבעלי חיים מפורט בפרוטוקול הטקסט. לאחר המתת חסד של בעל חיים באמצעות מנת יתר של הרדמה להזרקה, יש לבצע לפרוטומיה באמצעות אזמל או מספריים. בצע חתך מתהליך ה- xiphoid בצורה קלה לאורך קו האמצע.

לאחר מכן בעזרת אזמל ומלקחיים, הפרד בזהירות את העור ורקמת החיבור מהשרירים. הסר את הסרעפת על ידי משיכת תהליך ה-xiphoid כלפי מעלה וחיתוך הסרעפת מהעצם שמסביב. היזהר לא לפגוע בשריר הסרעפת.

העבירו את הצד העליון של הדיאפרגמה כלפי מעלה לתבנית קו סיליקון מלאה באלדהיד 4% פרפורם ב-PBS תחת סטריאוסקופ. הצמד את הרקמה המקיפה את הסרעפת, מותח את הסרעפת מתוחה. לאחר מכן הסר את רקמת החיבור מהמשטח העליון באמצעות מלקחיים ומספריים.

תן לקיבוע לעבוד במשך 20 דקות ולאחר מכן הסר אותו באמצעות שלוש שטיפות של 10 דקות ב-PBS. לאחר מכן, יש למרוח 0.1 גליצין מולארי עם 2% BSA ב-PBS למשך 30 דקות. לאחר מכן דגרו את הסרעפת בתמיסת טואין אלפא מצומד של מוט דומין למשך 15 דקות.

שטפו את רעלן הבונגלו עם PBS כפי שנעשה לקיבוע. לאחר מכן, החליפו את האמבטיה למתנול קר וצננו את הרקמה למשך חמש דקות בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס. לאחר חמש דקות מייד, הסר את המתנול ושטוף את הטישו עם PBS כמו קודם.

כעת, החל בלוק באמצעות תמיסה של 0.2% TBP למשך שעה. שנה את התמיסה לנוגדנים הראשוניים ב-0.2% TBP ותן לרקמה לדגור למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס בתסיסה עדינה. למחרת, השתמש בשלוש שטיפות של 10 דקות ב-0.2% TBP כדי להסיר את הנוגדן הראשוני, ולאחר מכן דגר על הרקמה בתמיסת הנוגדן המשנית למשך שעה עם נדנוד ובחושך מאוחר יותר, השתמש בשלוש שטיפות ב-PBS כדי להסיר את הנוגדן המשני ולשמור על הרקמה בחושך.

ואז תחת סטריאוסקופ, הסר רקמת חיבור נוספת על פני השטח העליונים של השריר. לאחר הניקוי, הר והדמיה של הרקמה תחת מיקרוסקופ אפי פלואורסצנטי זקוף, נתח כמותית את המורפולוגיה של דיאפרגמת ההמי המוכתמת. השתמש בהגדלה של פי 20 ו-40 מכיוון שהדיאפרגמה מנותחת כהרכבה שלמה.

רוב הכתמים הפלואורסצנטיים אינם ממוקדים. באמצעות מיקרוסקופ רגיל, עדיף לבצע את הניתוח בזמן אמת. על מנת לנקד כראוי את המורפולוגיה של ה- NM js הבודד, חלקו את השריר לשלושה חלקים לניתוח על סמך דפוסי העצבוב הטופוגרפיים של חוט השדרה.

החל מאזור רוב הגחון, נתח את כל ה-njs הגלויים לאורך סיבי השריר אינו מנתח עמוק יותר משלושת עד ארבעה הסיבים הראשונים מפני השטח מכיוון שחדירת הנוגדנים לעולם אינה שלמה. ל- NMJ שלם יש אקסון טרום טרמינלי עבה וכל אזורי מסוף העצב חופפים לחלוטין לקולטני האצטילכולין של השריר הבסיסי. NMJ חסר עצבים חלקית יגרום לאזורים מסוימים של קולטני האצטילכולין הבסיסיים להיות לא תפוסים.

NMJ מנותק לחלוטין לא יראה התאמה עם קולטני האצטילכולין במסוף העצבים. njs אחרים באזור צריכים להראות מורפולוגיה אחרת או את הצלחת הנוגדנים חדירה תהיה מוטלת בספק אם יותר מאקסון טרום טרמינלי אחד מעצבב NMJ. ה-NMJ הוא ריבוי.

ייתכן שניתוק עצבים עצבני התרחש במקרה זה, ואחריו עצבוב מחדש. אם יש חפיפה במסוף העצבים עם קולטני האצטילכולין הבסיסיים והאקסון הטרום טרמינלי דק מאוד, אז ה- NMJ עצבני דק. זה גם אינדיקציה לחזרה.

בניסוי שכלל ספרה בוגרים, קבוצת הביקורת של חולדות דולי עברה כריתת למינקטומיה בעוד שאחרות קיבלו SCI חד צדדי של חבלת הימי. ב-C ארבע. חמישה שבועות לאחר מכן, תועדה משרעת שיא ה-cmap מסרעפת ההמי במקביל לכריתת הלמינקטומיה או לאתר הפציעה.

הוא הופחת משמעותית בחולדות SCI בהשוואה לכריתת הלמינקטומיה רק חולדות ביקורת בניסוי אחר שכלל חולדות המבטאות אדם שעבר מוטציה, כך ש-D חלבון אחד שישמש כמודל של LS. מורפולוגיה של NMJ בסרעפת ההמי הייתה שלמה לחלוטין בחיות ביקורת מסוג בר. עם זאת, בחולדות הטרנסגניות, ה- njs הראו פתולוגיה משמעותית. חלקם הראו ניתוק עצבים מוחלט המסומן על ידי ראש החץ.

njs אחרים היו מנותקים חלקית כפי שמסומן על ידי ראש החץ, וכפי שניתן לראות ב-NMJ מימין, njs אחרים היו עצבניים כפולים, ולאחרים היו אקסונים טרום-טרמינליים דקים המסומנים כאן בראש ראש חץ. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להעריך כמותית את העצבוב התפקודי והמורפולוגי של הסרעפת על ידי נוירונים מוטוריים פרניים. תודה על הצפייה ובהצלחה בכל הניסויים שלך.