ייצור, אפיון ופוטנציאל שימושים של הוושט רירי דגם אדם מהונדס-רקמות 3D

המטרה הכוללת של הליך זה היא לייצר מודל תלת מימדי מהונדס רקמות של אפיתל הוושט האנושי לשימוש כפלטפורמה ניסיונית. זה מושג על ידי בידוד ראשון של פיברובלסטים ותאי אפיתל אנושיים רגילים מדגימות רקמת הוושט האנושית. בשלב השני, הפיברובלסטים נזרעים על גבי תאית אפיתלית, סימן נקבוביות, פיגום ושט, ומתורבתים במשך שבעה ימים.

לאחר מכן, הפיגום הופך ותאי האפיתל של הוושט האנושי המבודד מתווספים לתרבית למשך ארבעה ימים. בשלב האחרון, המודל מועבר לממשק נוזל האוויר למשך חמישה ימים נוספים של תרבית, מה שמאפשר לאפיתל מרובד בוגר להתפתח. בסופו של דבר, אימונוהיסטוכימיה משמשת לאפיון סמני מפתח של התפשטות והתמיינות המתבטאים על ידי תאי האפיתל של המודל.

היתרונות העיקריים של טכניקה זו על פני תרבית תאים דו-ממדית קונבנציונלית הם שהיא מאפשרת לתאים לקיים את האינטראקציות בין התאים, התאים ומטריצת התאים שיהיו להם in vivo. ובאמצעות טכניקה זו, אנו יכולים לייצר אפיתל קשקשי מרובד בוגר הדומה לוושט הרגיל. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו משלוש סיבות.

ראשית, זה יכול להיות אתגר להבטיח שרוב תאי האפיתל לא יתמיינו לפני שהם נכללים בפיגום. שנית, יש להקפיד על כך שממשק נוזל האוויר הנכון מסופק בתקופה שבה האפיתל מתבגר. ושלישית, זה יכול להיות אתגר לשמור על זוגיות לאורך כל תקופת התרבות.

כדי לבודד תאי אפיתל של הוושט האנושי, הניחו את רקמת רירית הקשקש של הוושט שנקטפה בצלחת פטרי סטרילית והשתמשו באזמל מעוקר אתנול כדי לחתוך את הרקמה לרצועות של 0.5 סנטימטר. לאחר מכן יש לדגור על הרקמה ב-0.1% בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, ולהפסיק את העיכול לאחר שעה עם חמישה מיליליטר FCS. לאחר מכן, החזיקו את הרצועות בעזרת מלקחיים, גרדו בעדינות את משטח האפיתל עם להב האזמל למשך דקה עד שתיים לכל רצועה כדי להסיר את תאי האפיתל לתווך שמסביב כאשר כל הרצועות נשרטו, העבירו את המדיום המכיל את תאי האפיתל המנותקים לצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר.

לאחר סיבוב התאים, השליכו את הסנה והשעו מחדש את הגלולה ב-12 מיליליטר של מדיום אפיתל. לאחר מכן השליכו את המדיום מתרבית תאים כבולים והשתמשו בפיפטה סטרילית כדי לצלחת את תאי האפיתל על תאי ההזנה כדי לבודד את הפיברובלסטים של הוושט האנושי. מעבירים את רצועות הרקמה המגורדות לצלחת פטרי סטרילית, ולבסוף טוחנים את הרקמה בעזרת האזמל.

עכל את החתיכות ב -10 מיליליטר של 0.5% קולגנאז, תמיסה מכוסה ב -37 מעלות צלזיוס ו -5% פחמן דו חמצני עם אווירה לחה למשך הלילה. למחרת, העבירו את העיכול לצינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר וסובבו את התאים. Resus משהה את החך ב -10 מיליליטר של תרבית פיברובלסטים בינוני.

התרבית בבקבוק T 75 בחממת תרבית תאים. כדי להכין את פיגומי הוושט של החזיר הנטול תאים, התחל באמצעות מספריים וזוג פינצטה כדי לחתוך את הוושט של חזיר לאורך. לאחר מכן, שטפו את הוושט בסיר סטרילי של 180 מיליליטר המכיל 100 מיליליטר PBS סטרילי למשך 10 דקות בניעור עדין כדי להסיר פסולת יום בזמן שטיפת הרקמה.

רססו לוח חיתוך פקק עם אתנול 70% כאשר הפקק יבש בוושט על הלוח כשהצד הרירי כלפי מעלה. כעת, השתמשו בפינצטה סטרילית כדי לתפוס את פני השטח הריריים בקצה אחד של הוושט ולמשוך את הרקמה הרחק מהלוח כדי להפריד את הרירית מהתת-רירית שמתחתיה. לאחר מכן, בעזרת להב אזמל סטרילי, חתכו את הוושט לאורך הלנר פרופריה, והסירו את הסיכות ככל שהדיסקציה מתקדמת כדי לאפשר להרים את הרירית.

השליכו את תת-הרירית הבסיסית והשתמשו באזמל כדי לחתוך את הרירית הנותרת לחתיכות מרובעות של חמישה סנטימטרים. שוטפים את החלקים ב -150 מיליליטר PBS סטרילי בתסיסה עדינה כפי שהודגם זה עתה. לאחר חמש דקות, העבירו את הרקמה לסיר של 180 מיליליטר המכיל 150 מיליליטר של תמיסת נתרן כלוריד מולרית אחת.

בתוספת אנטיביוטיקה ב-37 מעלות. לאחר 72 שעות, העבירו את הרקמה ל -150 מיליליטר של PBS סטרילי, ובשלב זה האפיתל יתחיל להיפרד באופן גלוי מהרקמה הבסיסית. השתמש במלקחיים סטריליים ובלהב אזמל כדי להסיר את האפיתל המתנתק ולהניח את הרקמה הנותרת בסיר טרי של 150 מיליליטר PBS סטרילי עם שלוש שטיפות של חמש דקות עם תסיסה עדינה, כעת יש לאחסן את הרקמה בגליצרול למשך ארבעה חודשים לפחות.

כדי לעקר את הפיגום במלואו, התחל בהכנת מודל רירית הוושט על ידי החזרת חתיכות פיגום חזיר שעברו עיקור בגליצרול במשך ארבעה חודשים לפחות. ב-100 מיליליטר PBS סטרילי לחמש תסיסה של 10 דקות. החלפת הסופינטה ב- PBS טרי לכל שטיפה.

לאחר מבחן התסיסה החמישי עקרות הפיגום עם דגירה לילית ב -100 מיליליטר DMEM ב -37 מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר, העבירו את הפיגומים לבארות בודדות של צד תת-רירי של שש בארות כלפי מעלה. לאחר מכן הנח טבעת נירוסטה סטרילית בדרגה רפואית על מרכז כל פיגום והשתמש במלקחיים סטריליים כדי ללחוץ בעדינות כלפי מטה על הטבעות כדי להבטיח אטימה נאותה עם הרקמה חמש פעמים.

מרכז את חמשת הפיברובלסטים הוושטיים האנושיים ב-0.2 מיליליטר של מדיום פיברובלסטים למרכז כל טבעת. לאחר מכן הציפו את האזור סביב החלק החיצוני של הטבעת בלפחות שני מיליליטר נוספים של מדיום פיברובלסטים ודגרו על הפיגומים בחממת תרבית תאים. לאחר 24 שעות, הסר את הטבעות והחלף את המדיום בכל באר בחמישה מיליליטר פיברובלסטים טריים לפחות.

בינוני, תוך הקפדה על כך שהפיגומים שקועים לחלוטין. לאחר שבוע, השליכו את המדיום והשתמשו במלקחיים כדי להפוך את פני הרירית של הפיגומים כלפי מעלה. הניחו את הטבעות בחזרה על הפיגומים, ולאחר מכן הוסיפו מרכז זמן אחד של ששת תאי האפיתל ב-0.2 מיליליטר של מדיום מרוכב, אחד למרכז כל טבעת.

חבר את האזור מחוץ לטבעת עם כשני מיליליטר של מדיום מרוכב אחד והחזיר את המבנים לחממה. לאחר 24 שעות, הסר את הטבעות והחלף את המדיום בכל באר בחמישה מיליליטר לפחות של מדיום מרוכב טרי, אחד, וודא שהפיגומים שקועים במלואם. לאחר 24 שעות נוספות, החלף את המדיום בחמישה מיליליטר לפחות של מדיום מרוכב. שניים.

ביום הרביעי, הנח רשתות רשת נירוסטה סטריליות בדרגה רפואית לבארות של צלחת חדשה של שש בארות והעביר את המבנים לרשתות הצד הרירי כלפי מעלה. לבסוף, הוסף מספיק מדיום מרוכב שלוש כדי להגיע לצד התחתון של המרוכב תוך השארת המשטח חשוף לאוויר, ולהבטיח שהדגימה נשמרת בממשק נוזל אוויר. החלק המסובך ביותר בהליך הוא הגדרת ממשק נוזל האוויר.

אם לא ברור אם הרשת נמצאת במגע נוזלי עם קצה סטרילי לצינור, מכיוון שקל יותר לראות אם הצינור שקוע. לחלופין, אתה יכול לנסות לנדנד את הצלחת בעדינות מכיוון שקל יותר לראות נוזל כשהוא זז ולבדוק שיש נוזל על הרשת ולא מכסה את הדגימה שלך. זו, ההערכה ההגיונית של האפיתל מציגה אפיתל קשקשי מרובד רב-שכבתי בוגר, דומה אך דק יותר לזה שנצפה בוושט האנושי הרגיל כאשר התאים הופכים שטוחים יותר ובסופו של דבר גרעיניים כשהם נודדים לעבר פני השטח.

אפיון אימונוהיסטוכימי של סמני מפתח של התפשטות והתמיינות מדגים כי המיקרואנטומיה של אפיתל המודל דומה לזו של אפיתל הוושט האנושי הרגיל. לדוגמה, ביטוי ציטוקרטין 14 דומה נצפה הן בוושט המקורי והן באפיתל המודל עם צביעה מוגבלת לתאים בשכבת הבסיס. מודל זה שונה בהצלחה כדי לשלב תאי גידול על ידי החלפת תאי האפיתל הראשוניים בתאי קרצינומה המדגימים את גמישות המודל.

לדוגמה, תאי קרצינומה קשקשית מייצרים אפיתל הנראה על המבנה כאזור צהוב מוגדר עם סדקים גדולים בתוך האפיתל, המשקף ככל הנראה נוכחות של מולקולות צליה לא מתפקדות, כולל תאי אדנוקרצינומה של הוושט בתוך המודל מביא לכמות גדולה של פירוק פיגומים הנראה לעין כדילול של הפיגום. לאחר שבועיים של גידול בממשק נוזל האוויר ואושר בניתוח h ו-e כהפחתה ברורה בעובי הפיגום באזור שמתחת לתאים בעקבות הליך זה, ניתן ליישם שיטות אחרות לביטוי גנים כמו כתמים צפוניים או מערביים על אותה רקמה כדי לענות על שאלות כמו, כיצד מגיב האפיתל ללחצים סביבתיים? אז זה מספק משאב בעל ערך אמיתי להתבוננות בשאלות נוספות לעומק לאחר פיתוחו.

טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים המתעניינים במטפלזיה של בארט לחקור את השפעת החשיפה לרכיבי ריפלוקס ספציפיים על ביטוי גנים בוושט האנושי הרגיל.