בVivo הדינמיקה של רשתית microglial הפעלה במהלך מוחיה: Confocal Ophthalmoscopic הדמיה וMorphometry הסלולרי בעכבר גלאוקומה

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לאפיין דינמיקת מיקרוגליה במודל עכבר של גלאוקומה כרונית על ידי הדמיה קונפוקלית in vivo של הרשתית. זה מושג על ידי אופטלמוסקופיה קונפוקלית חודשית לא פולשנית או CSLO כדי לראות את המיקרוגליה הפלואורסצנטית על הרשתית וראש עצב הראייה. ניתוח תמונה חיה באמצעות פילוח SOMA של תאים מבוססי סף ומורפו מכמת שינויים במספר תאי המיקרוגליה והפעלה.

התוצאות מראות כי ניתן להשתמש בהדמיית CSLO חודשית בעכברים חיים כדי לנטר את הקינטיקה של התפלגות צפיפות תאי המיקרוגליה וההפעלה המורפולוגית במהלך ההתקדמות המוקדמת של ניוון עצבי כרוני. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו הדמיה קונפוקלית של שני פוטונים של מוח עכבר מיקרוגליה חיובי GFP הוא שהדמיית CSLO של הרשתית מאפשרת תצפית וניטור ישירים של תאי מיקרוגליה לאורך התקדמות הפרעות ניווניות של הזדקנות באורגניזם השלם. הרעיון לשיטה זו עלה לי לראשונה לאחר שהדגמנו exvivo, שמיקרוגליה הראתה הפעלה אינטנסיבית והתקבצות במוכנות המרכזית של DBA צעיר דרך עכברי J בגילאים שקדמו לניוון עצבי שניתן לזהות.

כדי לשאול אם השינויים החיסוניים המולדים המוקדמים האלה שקדמו לגלאוקומה הניתנת לזיהוי גרמו לניוון העצבי שלה, היינו צריכים לבסס גישה in vivo כדי לעקוב אחר שינויים במיקרוגליה. מדגים את ההליך לרכישת תמונה חיה יהיה קיסר רומרו, טכנאי במעבדה שלי כדי להתחיל בפעילות, הפעל את מערכת CSLO והזן את פרטי ההפעלה. לאחר מכן, התכוננו להדמיה בצורה מאובטחת.

חבר עדשת אובייקט נקייה ברוחב 55 מעלות. הניחו עכבר על פלטפורמת ההדמיה שתי דקות לאחר מתן חומר ההרדמה והרחיבו את שני האישונים באמצעות טיפות הטאט שלי. חמש דקות לאחר מכן, ודא שהעכבר מורדם

לאחר מכן, בלחץ מינימלי יש לכסות כל עין בעדשות מגע. כוון את העכבר כך שהעין הימנית תפגוש את עדשת האובייקט והמסלול יהיה מקביל לעדשה. אין צורך לרסן את החיה אלא לשמור עליה במרחק קבוע מעדשת האובייקט.

כאשר העין מיושרת איתו במשך 10 עד 15 הדקות הבאות, העכבר לא יזוז או ימצמץ בזמן שתנועות העיניים שלו עוקבות אחר מערכת ההדמיה החיה של CSLO. התחל את סשן ההדמיה על ידי איסוף מבט על הפונדוס של הרשתית הפנימית. בשביל זה.

בחר את מצב האינפרא אדום, המתאים לאורך גל עירור של 820 ננומטר. לאחר מכן כוונן את עוצמת הלייזר ל-100% ואת הרגישות בין 40 ל-60%לאחר מכן, בעבודה במהירות גבוהה, אתר את העין באמצעות הג'ויסטיק כדי לכוון את האופטלמוסקופ והתכונן לאסוף מבט פונדוסי על הדיסק האופטי וכלי הדם ברשתית. בדוק את הקרנית והעדשה לאיתור פציעה או אטימות.

אל תכלול מהמחקר עיניים עם פגמים או פציעות שעלולות להשפיע על רכישת התמונה. כעת, על ידי קירוב האובייקט לעין, אתר את אזור הדיסק האופטי, שהוא פני השטח של ראש עצב הראייה או ONH. לאחר מכן מרכז את התמונה על ה-ONH.

מיקום נכון של ה-ONH הוא המפתח להשגת מיקוד אחיד ומשימה על פני התמונה. השלב הבא הוא לדמיין את המישורים הפנימיים של הרשתית כמו גם את ה-ONH. עבור מישור מוקד ייחוס, השתמש בכלי דם עיקריים הממוקמים על פני הזגוגית של הרשתית, המתאימים ל-59 ו-60 דיופטר, או אפילו עמוק יותר ב-55 דיופטר באזורי דיסק אופטי שנחפרו.

לאחר מכן, כוונן את רוויית התמונה באמצעות הכפתור בלוח המגע עד שהילה לבנה של תאורה משתרעת על פני רוב הפונדוס סביב הדיסק האופטי. לאחר מכן בחר את הרוויה הנמוכה יותר שהופכת הילה אחידה המעידה על ניגודיות אופטימלית עבור אותה עין. ייתכן שיהיה צורך ליישר מחדש את המצלמה אם אזורים כהים נמשכים.

כעת, אסוף תמונת פונדוס ברזולוציה גבוהה של הרשתית המרכזית על ידי ממוצע של 30 פריימים שצולמו בזמן אמת כדי לשפר את יחס האות לרעש. זה מתאים ל -4.7 פריימים לשנייה, מנורמל מיד ובאותו מיקום מוכן לאסוף תמונה פלואורסצנטית של התאים החיוביים של GFP. עבור למצב הדמיה פלואורסצנטית בלוח מסך המגע, הבוחר את הלייזר הכחול עם עירור לייזר של 488 ננומטר וסט מסנני מחסום של 460 עד 490 ננומטר ומגדיר את הרכישה לעוצמת לייזר של 100% ורגישות של 100 עד 125%.

כעת אסוף תמונת פלואורסצנציה דו-ממדית אחת של נקודת XY של ה-ONH בממוצע של 100 x סריקות. לאחר מכן, צלם תמונה מרובת נקודות של הרשתית סביב מרוכב בחירת ONH בלוח הבקרה, ולאחר מכן פנורמה עם האופטלמוסקופ על פני הציר הטמפורלי של האף. התוכנה מבצעת ממוצע אוטומטי של אזורים שנסרקו לאחרונה ותופרת אותם בזמן אמת.

אם איכות התמונה של אזורים ברשתית אינה מספיקה כדי לאפשר חישוב ממוצע, העיגול הירוק המזהה אזור נסרק יהפוך לאדום. התמונה המרוכבת המתקבלת מכסה שטח של עד 1.7 על ארבעה מילימטרים. יש לנקוט בזהירות במהלך רכישת התמונה המורכבת.

תמונות ברזולוציה גבוהה עלולות ללכת לאיבוד על ידי הזזת המטרה מהר מדי לפני השלמת ממוצע הסריקה ותפירת התמונה. כאשר ההרדמה מתחילה להתפוגג, סשן ההדמיה חייב להסתיים מכיוון שהעכבר מתחיל לנשום בכבדות וההדמיה הופכת לבלתי מעשית. התחל ביישור רציף של תמונות הפונדוס לסדרת זמן תוך שימוש בכלי הדם ובדיסק האופטי כציוני דרך.

באמצעות תוכנת עריכת תמונות קונבנציונלית מסדרים את כל התמונות עד שה-O hs שלהן חופף. התמונה העליונה תהיה שקופה למחצה בזמן הגרירה. לאחר מכן סובב כל תמונה ברצף עד שכלי הדם העיקריים שלה חופפים לכלי הדם בתמונה הקודמת ושמור את הסידור לעיון עתידי.

רשום את הזווית המתוקנת עבור כל תמונה והחל אותה על תמונת הקרינה של נקודת XY היחידה המתאימה. כעת ניתן לזהות תאי מיקרוגליה חיוביים בודדים של GFP הממוקמים במרכז הרשתית על ידי פתיחת קבצי ה-TIFF המיושרים בעיבוד פלואור. כדי להמחיש את כל התאים, מלא את המסך בתמונה והגדר את תצוגת הרינדור מורכבת אורתוגונלית ואינטרפולציה.

לאחר מכן הגדר את המאפיינים 0.58 גמא 255 נקודת רוויה 255 בהירות 195 אלפא בהצללה של 1.00. סיים את הבחירות על-ידי בחירת שני ערוצי RG כגלויים. הסתר ערוץ B על-ידי לחיצה כפולה עליו במסגרת סביבת העבודה כדי לפלח תאים בודדים.

בחר וסף את הערוץ האדום על ידי הגדלת הסף הנמוך עד שרוב התאים מוסווים עם חפיפה מינימלית ואי הכללת תהליכי תאים תוך שמירה על קבוע הסף הגבוה. לבסוף, שמור את הקובץ עם תאים עם מסיכה באמצעות פקודת הלכידה. פתח את התמונה עם תאים עם מסיכה בעורך הגרפי של הרסטר שם.

הפוך את הסולם האפור לתצפית ישירה והתאם את הרזולוציה ל-300 DPI ומעלה. תמונת RGB נשמרת כקובץ TIF. השלב הבא של ניתוח תמונה חיה הוא של מיקרוגליה, כלומר פילוח ומורפו לזיהוי SATA לכימות שטח.

השתמש בתוכנה המסוגלת למדידות עוצמה וספירת אובייקטים על סמך סף. פתח את קובץ ה-TIFF עם תאים מפולחים ובחר את שינוי קנה המידה של הקו לרזולוציה מקסימלית ואת הערוץ האדום בשחור-לבן להדמיה טובה יותר. לאחר מכן, כייל את התמונה על ידי הגדרת הקוטר האופקי שלה כ-1.4 עד 1.7 מילימטרים בהתאם לגיל כדי לפלח תאים בודדים.

אז MA, החל סף עוצמה על הערוץ האדום. פתח את פונקציית עוצמת הסף תחת ספירת אובייקטים ופקודת עדכון חשבון. השתמש בפונקציה זו כדי לעקוב אחר פרמטרים דו-ממדיים עבור כל סף של אזור עניין המייצג אדם.

אז לאחר מכן, הגדר את סף העוצמה בהיסטוגרמה של העוצמה. בחר את 50 עד 60% הנמוכים ביותר מבין 255 הרמות ומקד את ערך הסף הסופי של התאים הבודדים. הערך חזותית את החפיפה בין מסיכת צבע הסף בכחול לבין היקף הסומה של התא באפור באמצעות פקדי סרגל הכלים הבינארי או קטלוג האובייקטים.

זיהוי ידני של אזורי עניין סומליים עם תאים מרובים. הפרד את האלמנטים הללו על ידי הפרדת אזורי העניין. תוך כדי כך, השתמש במתג כדי להמחיש ישירות את התאים כעת באמצעות הגבלת שטח.

סווג תאי מיקרוגליה כמופעלים. אם שטחי הסומטה שלהם גדולים מ-50 עד 60 מיקרון רבוע. סווג את המיקרוגליה כמנוטרלת אם יש להם סומטה קטנה יותר.

לבסוף, אמת את התהליך ובדוק את מורכבות ההסתעפות בכל תא מיקרוגליה מופעל על ידי כיסוי המסכה הסומלית ותמונת נקודת ה-XY היחידה עם הניגודיות גדלה ב-50%הפרוטוקול המתואר שימש להדמיית תאי מיקרוגליה על פני שטח גדול של הרשתית המרכזית. ב-DBA צעיר שני עכברי J הטרוזיגוטיים המבטאים CX שלוש C אחד GFP, רזולוציית התאים הגבוהה בשילוב עם תמונה חיה, סף וניתוח מורפומטרי אפשרו סגמנטציה אוטומטית של תאים חיוביים בודדים של GFP, וכך התאים מופלים על סמך אזור DBA שני עכברי J מודל גלאוקומה כרונית וצולמו מדי חודש כדי לעקוב אחר התפתחות מיקרו גליוזיס מקומית והפעלת מיקרוגליה בגילאים המתקדמים לניוון עצבי הניתן לזיהוי בהתאם למשתנה התקדמות של ניוון עצבי בעיניים בודדות. ניתוח זה חשף שינויים בהפעלת מיקרוגליה ברשתית ובמיקרו גליוזיס עם הזמן.

הניתוח זיהה גם שינויים דינמיים בצפיפות המיקרוגליה הכוללת והמופעלת בתוך רשתית בודדת. צפיפות אוכלוסיית המיקרוגליה לא הייתה קשורה לשינויים ב-GFP המבטאים צפיפות תאים התואמים לממצאים אחרים. לפיכך, ניתוח CSLO יכול לשמש כאינדיקטור להתקדמות מוקדמת של המחלה.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לבצע אופטימיזציה קפדנית של רמות הרוויה של התמונה הפלואורסצנטית של GFP בתוספת מיקרוגליה, מיקום הרשתית הפנימית, יכולת השחזור של תמונות CSLO של הרשתית המרכזית, כמו גם הפרט התאי העקבי שזוהה על פני הרשתית המרכזית תלויה באופן קריטי בשלב זה לאחר התפתחותו. פרוטוקול הדמיה חי זה מיושם במעבדה שלנו, ומרגיע באמת את הקשר הפוטנציאלי בין שינויים מוקדמים במיקרוגליה של ראש הרשתית וראש עצב הראייה, לבין התקדמות מאוחרת יותר של גלאוקומה ב-DBA ל-JM ובמודלים אחרים של ניוון כרוני של הרשתית. אסטרטגיית הדמיה חיה זו עשויה גם לאפשר גילוי מוקדם של פתולוגיות כרוניות אחרות המכוונות גם לרשתית ולעצב הראייה לניוון כגון טרשת נפוצה, אלצהיימר ומחלת פרקינסון.