יישום של ה- DNA ספציפי הכתם מתיל הירוק בתיוג פלורסנט של עוברים
2 במאי 2015
מתוארת שיטה לצביעה פלואורסצנטית של חומר ביולוגי קבוע עם תווית ה-DNA הספציפית מתיל ירוק. מתיל ירוק משמש בתמיסה מימית מדוללת ועמיד מאוד בפני פוטוהלבנה. הפליטה האדומה הרחוקה שלו מאפשרת הדמיה עמוקה של דגימות, מה שהופך אותו למתאים במיוחד לעוברים שלמים.
בסרטון זה, נראה כיצד הכתם ההיסטולוגי הנפוץ מאוד מתיל ירוק יכול לשמש כתווית גרעינית נוחה במיוחד במיקרוסקופיה פלואורסצנטית עם היישומים המיוחדים במיקרוסקופיה קונפוקלית לייזר של דגימות ביולוגיות עבות כגון עוברים שלמים. לאחר שהכנסנו זמן קצר את המתיל גרין ככתם ספציפי ל-DNA, נתאר את השיטה להכנת מלאי ופתרונות עבודה לצביעה פלואורסצנטית. לאחר מכן נציג את הליך הניסוי להשגת צביעה גרעינית ונחזיק מספר עוברי דגים ודוגמאות של תמונות קונפוקליות שהושגו.
לבסוף, התכונות הכימיות הפיזיקליות המצוינות של מתיל ירוק יודגמו ונדונו. פרדי מישה גילה את הדנ"א ב-1869 והראה כמה שנים מאוחר יותר שהוא יוצר משקעים עם טבעת חדשה יחסית וצבע ירוק מתיל למתיל ירוק יש שני מטענים חיוביים המאפשרים לו לקיים אינטראקציה חזקה עם ה-DNA בקבוצה העיקרית שלו, ולהיקשר באופן מועדף לאזורי הגעה.
השימוש המורחב ביותר במתיל ירוק היה שילובו בתמיסת אף עם פרין כתם RNA, מתיל שפותח על ידי UNA ופופן היים בתחילת המאה ה-20. עם זאת, מעט מאוד נותח על תכונות פלואורסצנטיות של מתיל ירוק, וזו הסיבה שהחלטנו לבדוק את האפשרות שהוא יכול לשמש כזיקה גבוהה מאוד ותווית פלואורסצנטית ספציפית. עבור DNA על תאים.
מתיל ירוק הוא כתם אל מתאן עם שבעה שורשי מתיל. קבוצה שביעית זו הולכת לאיבוד בקלות והיא חוזרת לסגול קריסטל. מסיבה זו, יש כמות הגעה של סגול קריסטל מעורבב עם ירוק מתיל להסרת קריסטל.
ניתן לשטוף תמיסת מתיל ירוקה סגולה עם כלורופורם כדי לחלץ סגול קריסטל. כפי שנראה מיד למטרה זו, אנו מכינים תמיסת ACU 4% מתחת למכסה אדים. אנו מערבבים אותו עם לפחות שני חלקים של כלורופורם וצנטריפוגה כדי להאיץ את הפרדת הפאזה.
לאחר הצנטריפיקציה, אנו מקבלים פאזה מימית עם מתיל ירוק ושלב אורגני נמוך יותר עם כלורופורם וסגול קריסטל. שחזרנו את השלב העליון וחזרנו על כך עד שהשלב התחתון נראה ברור. בסוף, השלב העליון מתאושש ומדולל.
הפתרון הזה הוא אורווה על שולחן העבודה במשך חודשים. כעת נראה כיצד להמשיך לטפל ב-MO שלם בשכבת עוברים עם ירוק מת'. למיקרופון קונפוקלי, נשתמש בעובר הדגים המושתל הגבוה.
כדוגמה, השג עוברי דג זברה ושטוף את הפסולת בעזרת מסננת. דגרו אותם לשלב הרצוי במי מיכל דגים או במדיום עוברי. הסר את הקוריום בעזרת פינצטה עדינה, תקן את העוברים ב -4% לפורמלדהיד למשך כמה שעות או למשך הלילה.
לאחר מכן שטפו את העוברים ב- PBST מספר פעמים. הכן תמיסת עבודה מתיל ירוק על ידי דילול תמיסת המלאי חמש עד 10,000 פעמים ב-PBST. דגרו על העוברים בתמיסה למשך שלוש שעות לפחות בטמפרטורת החדר או למשך הלילה של ארבע מעלות צלזיוס נמוכות.
בדוגמה זו, תמונות קונפוקליות יתקבלו במיקרוסקופ קונפוקלי פחות עם גלאים ספקטרליים. עירור מקסימלי מושג בלייזר 633 ננומטר והגלאי מכוון לטווח רחב. באזור האדום של הספקטרום הנראה.
פליטת מתיל ירוק אדום מאפשרת לקבל הדמיה גרעינית באיכות טובה אפילו מדגימות עמוקות כמו עוברים שלמים עם אובדן אות מינימלי. סדרה ראשונה זו מציגה רשתית של דג זברה שגרעיניה הוכתמו בכתם DNA מבוסס היטב לפרו שלוש. אחרי דקה אנחנו מתרחקים.
אזור סריקת ABL מתגלה כאשר אנו מבצעים את אותו ניסוי עם מתיל ירוק, לא נראית הלבנה ניכרת. בסדרה הבאה אנו מציגים תוצאות מייצגות של מה שניתן להשיג באמצעות הפרוטוקול המתואר כאן, תא מיטוטי מאפידרמיס דג הזברה בו ניתן לצפות בדמויות מיטוטיות. גרעין IIC מאותה דגימה שבה ניתן לראות ארכיטקטורה גרעינית.
שחזור תלת מימדי של חלק מתא אפידרמיס של זחלי דג זברה המסומן במתיל ירוק אמלין, מבט פנורמי יותר על צורות גרעיניות שונות תוך 48 שעות הפריית פורט, דג כסף, רשתית בר. הראינו כאן דרך קלה להכין כתם DNA פלואורסצנטי זול ביותר שניתן להשתמש בו בתווית גרעינית, למרות שאנו מראים רק כדוגמה, את האחיזה בכמה. טכניקה זו יכולה לחול על העוברים או הרקמות שלך, בין אם תושבת שלמה או חתך.
זה יכול לשמש גם לצביעת DNA בג'לים ולקביעת DNA בתמיסה באמצעות פוטומטריה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר שיטה לצביעה פלואורסצנטית של חומר ביולוגי מקובע באמצעות methyl green, סימון ספציפי ל-DNA. פליטת האור באורך גל של far-red של methyl green מאפשרת הדמיה עמוקה של דגימות, מה שהופך אותו למתאים לעוברים שלמים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מיקרוסקופיה פלואורסצנטית
- צביעה היסטולוגית
- דימוג ביולוגי
רקע
- מתיל גרין (Methyl green) הוא צבע היסטולוגי נפוץ.
- הוא מקיים אינטראקציה חזקה עם DNA, ונקשר באופן מועדף לאזורים עשירים ב-AT.
- הדבר התגלה בהקשר של מחקר DNA בשלהי המאה ה-19.
- הצבע עמיד בפני דהייה פוטוכימית (photobleaching), דבר המשפר את יעילותו במיקרוסקופיה.
מטרת המחקר
- להדגמת השימוש במתיל גרין (methyl green) כסמן גרעיני במיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
- לספק שיטה להכנת תמיסות מלאי ותמיסות עבודה לצביעה.
- להצגת דימות קונפוקאלי של דגימות ביולוגיות עבות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת תמיסות מלאי ותמיסות עבודה של methyl green.
- צביעה פלואורסצנטית של חומר ביולוגי מקובע.
- יישום מיקרוסקופיה קונפוקאלית בלייזר.
- דימוג של עוברים שלמים וניתוח של תמונות קונפוקאליות.
תוצאות עיקריות
- צביעה גרעינית מוצלחת של עוברים של דגים באמצעות methyl green.
- הדגמה של יכולות דימוי מצוינות הודות לתכונותיו של methyl green.
- תמונות קונפוקאליות שהתקבלו מראות סימון גרעיני ברור.
- עמידותו של methyl green להבהרה פוטוכימית (photobleaching) אוששה.
מסקנות
- Methyl green הוא סמן גרעיני יעיל למיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
- תכונותיו הופכות אותו למתאים לדימוי של דגימות ביולוגיות עבות.
- ניתן ליישם את השיטה בהקשרים שונים של מחקר ביולוגי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
סימון גרעיני פלואורסצנטי באמצעות מתיל גרין (methyl green) מאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה של גרעינים בדגימות ביולוגיות עבות, ובכך תומך בתהליכי גילוי מוקדם ותיקוף של מטרות. היציבות שלו, הספציפיות ל-DNA והתאימות למיקרוסקופיה קונפוקלית מספקות ביטחון חיזוי עבור ניתוחים ברמת התא והרקמה. יכולת זו משפרת את קבלת ההחלטות בניהול פורטפוליו על ידי מתן אפשרות להדמיה חזקה וניתנת לשחזור במערכות מודל מורכבות.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר הדמיה גרעינית מדויקת עבור מחקרים מונחי-השערה בתאים וברקמות מקובעים.
- תומך בתיקוף תפקודי של מטרות על ידי מתן אפשרות לזיהוי ברור של הארכיטקטורה הגרעינית.
- מפחית עמימות מכניסטית במודלים תאיים באמצעות סימון ספציפי ל-DNA.
- מאפשר סינון בטוח של מטרות פוטנציאליות על בסיס נתוני הדמיה ברמת דיוק גבוהה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מכין מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף עבור תהליכי עבודה של דימוי בעל תוכן גבוה (high-content imaging) בשלבים הבאים.
- מספק סימון גרעיני כמותי וניתן לשחזור, החיוני לסטנדרטיזציה של הבדיקה.
- תומך ביכולת הרחבה ובשימוש חוזר בפלטפורמה הודות ליציבותו ולעלותו הנמוכה של methyl green.
- מאפשר הערכה אמינה של תרכובות על ידי מזעור של דה-פוטו-בליצ'ינג (photobleaching) ואובדן אות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם מערכות מודל רלוונטיות למחלה על ידי מתן אפשרות לדימות של עוברים שלמים ורקמות עבות.
- שומר על רצף משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות סימון גרעיני חזק.
- תומך בקידום מבוסס ניהול סיכונים על ידי אספקת תוצרי דימות עקביים בין מודלים שונים.
- משפר את צמצום הסיכונים החזוי באמצעות תאימות לפרוטוקולים של צביעה מרובת-סמנים (multiplexed staining).
שילוב תהליכים וזרימת עבודה
סימון פלואורסצנטי של מתיל גרין (Methyl green) משתלב ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות מוקדמות ועד להדמיה פרה-קלינית, ותומך בתהליכי עבודה הדורשים ויזואליזציה גרעינית חזקה בדגימות מורכבות.
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת בדיקת השערות והבהרת מסלולים באמצעות דימוי גרעיני ספציפי ל-DNA.
- סריקה: מספקת סימון גרעיני הניתן לשחזור ומוכן לבדיקה עבור פלטפורמות סריקה בעלות תוכן גבוה (high-content screening).
- אנליטיקה: מספקת קריאות כמותיות ויציבות פוטו-כימית לצורך ניתוח השוואתי של תנאים תאיים.
- מחקר תרגומי: תומכת בהלימה של סמנים ביולוגיים ובהמשכיות במודלים רלוונטיים למחלות.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פתרון סימון יציב וכלכלי הניתן להתאמה למגוון תוכניות מו"פ.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי ומפחית עמימות בדימות גרעיני.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה, השחזוריות והיכולת להרחבה (scalability) בתהליכי עבודה של דימות.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך התהליך (go/no-go) ואת יעילות ההון על ידי מתן אפשרות ליצירת נתונים איתנים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכון ובקידום של תוכניות גילוי.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרוסקופיה קונפוקאלית ובטכניקות של דימוי פלואורסצנטי.
- דורש גישה לגלאים ספקטרליים ולמקורי עירור לייזר תואמים (למשל, 633 nm).
- דורש סטנדרטיזציה של פרוטוקולי צביעה ודימוי בין צוותים כדי להבטיח שחזוריות.
- ניתן להתאמה למערכות מודל מקובעות שונות, כולל עוברים שלמים וחתכי רקמה.
- מוגבל לדגימות מקובעות; אינו מתאים לדימוי גרעיני של תאים חיים.
