אבלציה Hepatocyte הספציפי בדג הזברה לחקר התחדשות כבד מונע מרה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לגרום לאבלציה של הפטוציטים בדגי זברה לניתוח התחדשות כבד מונעת מרה. זה מושג על ידי חשיפה ראשונה של זחלים טרנסגניים המבטאים ניטרו רדוקטאז בהפטוציטים שלהם למטרונה או MTZ. בשלב השני, רמת אבלציה של הפטוציטים מוערכת על סמך גודלו היחסי של הכבד.

לאחר טיפול MTZ בשלב האחרון, זחלים בריונים עם כבד זעיר נאספים בסופו של דבר בגודל הכבד וביטוי סמני הכבד בכבד המתחדש נמדד על ידי אפי פלואורסצנטי ומיקרוסקופיה קונפוקלית בהתאמה. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו מודלים להפעלת תאים סגלגלים של מכרסמים הוא שבטכניקה זו, הפטוציטים המתחדשים נגזרים בעיקר מתאי אפיתל מרה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום התחדשות הכבד, כגון כיצד תא מרה או תאי אב כבד תורמים להתחדשות הכבד בדרך כלל אינדיבידואל לחדש בשיטה זו יתקשה מכיוון שגודל הכבד במעבדה של עופרת וניוון משתנה.

כדי לבצע הזדווגות מתוזמנת, הציבו דגים בוגרים זכרים ונקבות המיזיגוטים או הומוזיגוטיים למשך הלילה עם מחיצה ביניהם. הסר את המחיצה למחרת בבוקר כאשר רוצים להזדווג, השתמש במסננת רשת פלסטיק עדינה כדי לקצור את העוברים, הפוך את המסננת והשתמש בבקבוק סחיטה כדי לשטוף את משטח הרשת בזרם דק של מי ביצים. לאחר מכן העבירו עד 100 עוברים לצלחת פטרי בגודל 100 מילימטר המכילה 25 מיליליטר מי ביצים, והניחו את המנה בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס כדי לעכב פיגמנטציה.

הוסף PTU לתרבית עד 10 שעות. לאחר הפריה לאחר 80 שעות. לאחר ההתאמה האישית, הרדמו את הזחלים עם טריקה והשתמשו במיקרוסקופ אפי פלואורסצנטי כדי לאסוף את הזחלים החיוביים ל-CFP, תוך שמירה רק על בעלי החיים עם כבד בגודל דומה.

לאחר מכן החלף את מי ביצי הטריקה במי ביצים טריים בתוספת PTU והחזיר את זחלי דג הזברה החיוביים ל-CFP לחממה של 28 מעלות צלזיוס. כדי לטפל תחילה בזחלי דג הזברה עם MTZ, חלקו את המספר המתאים של הזחלים לשני כלי תרבות שונים. שמור את קבוצת זחלי הניסוי בתמיסה של MTZ טרי ואת קבוצת הביקורת במי ביצים.

בתוספת DMSO. מכסים את קבוצת הניסוי בנייר אלומיניום כדי למנוע השבתת פוטו של ה-MTZ ודוגרים על שתי קבוצות זחלי דג הזברה ב-28 מעלות צלזיוס בסוף תקופת האבלציה. מוציאים את תמיסת ה-MTZ מהצלחות ושוטפים את הזחלים שטופלו ב-MTZ פעמיים-שלוש עם 25 מיליליטר מי ביצים ומסתחררים וזורקים את מי הביצים לאחר כל שטיפה.

לאחר השטיפה האחרונה, יש לשתק את הזחלים עם מחצית מריכוז הטריקה ששימש בעבר למניעת בצקת לב ומוות בזחלים שטופלו ב-MTZ. לאחר מכן השתמש במסנן CFP במיקרוסקופ פלואורסצנטי אפי כדי להעריך את רמות אבלציה של הפטוציטים בהתבסס על גודל הכבד היחסי של הזחלים שטופלו ב-MTZ. קחו בחשבון את דגי הזברה עם כבדים גדולים המייצגים אפס עד 5% מהזחלים כבלתי ניתנים.

אלה עם כבד בגודל בינוני המייצגים 10 עד 20% מהזחלים שיש לכרות חלקית ואלה עם כבדים קטנים מאוד המייצגים 80 עד 90% מהזחלים שיש לכרות באופן מלא. לאחר סיווג כל בעלי החיים, גלה את הזחלים עם כבד לא מנותק או שעבר כריתה חלקית, תוך שמירה רק על דגי הזברה עם כבד זעיר המעיד על אבלציה חמורה של הפטוציטים לניתוח כבד. בנקודת הזמן של שעת האפס להתחדשות, העבירו את הזחלים לצינור מיקרו צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר.

מיד לאחר שטיפת ה-MTZ ומקור CFP, החלף את מי הביצים במאגר MPEM פורמלדהיד 3% לקיבוע לילה על רוטור של ארבע מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר, החליפו את תמיסת הקיבוע במיליליטר אחד של P-B-S-D-T וסובבו את הזחלים למשך חמש דקות נוספות. לאחר מכן, כל הזחלים הקבועים לתוך צלחת פטרי בגודל 100 מילימטר המכילה P-B-S-D-T טרי תחת מיקרוסקופ מנתח והשתמשו במלקחיים כדי להסיר ידנית את החלמון וסנפירי החזה כאשר כל הזחלים נחתכו.

העבירו עד 20 בעלי חיים לתוך שפופרת של 1.5 מיליליטר והחליפו את ה-P-B-S-D-T במיליליטר אחד של תמיסת חסימה. לאחר שעתיים על המסובב בטמפרטורת החדר, החלף את תמיסת החסימה ב-100 מיקרוליטר של קוקטייל הנוגדנים הראשוני לדגירה של לילה בארבע מעלות צלזיוס. עם הנדנוד למחרת, הסר את תמיסת הנוגדנים העיקרית ושטוף את דג הזברה עם P-B-S-D-T למשך חמש שטיפות של 10 דקות.

לאחר הכביסה האחרונה, הוסיפו 100 מיקרוליטר של הנוגדן המשני למשך שעתיים דגירה בטמפרטורת החדר עם נדנדה. לבסוף, שטפו את הזחלים חמש פעמים ב-P-B-S-D-T כפי שהודגם זה עתה. כוונו את הזחלים לרוחב על שקופית מיקרוסקופ והוסיפו טיפה של אמצעי הרכבה.

לאחר מכן מכסים בזהירות כל דג זברה בכוס כיסוי ואוטמים את זכוכית הכיסוי בלק. טיפול MTZ במשך 36 שעות מ-3.5 עד חמישה ימים לאחר ההפריה מפחית באופן דרמטי את גודל הכבד. לאחר שטיפת ה-MTZ, ביטוי חזק של CFP ואדום מופיע שוב תוך 30 שעות, כפי שהוערך על ידי ביטוי LCAM בקרום תאי האפיתל של המרה.

רשת המרה התוך-כבדית קורסת בתחילה, אך לאחר מכן נוצרת מחדש 54 שעות לאחר השטיפה המצביעה על התחדשות והתאוששות מהירה של הכבד. בתמונות אלה מחדשים הפטוציטים טרנסגניים לחלבון פלואורסצנטי אדום גרעיני המתבטא אך ורק בתאי האפיתל של המרה של הכבד מוצגים רוב התאים החיוביים לדובדבן H שני BM בכבד המתחדש מבטאים HNF ארבע אלפא בשעת התחדשות אפס בשעת התחדשות ארבע C שמונה. הפטוציטים החיוביים ל-CFP שטופלו ב-MTZ עדיין שומרים על ביטוי הדובדבן H 2 BM שלהם, מה שמצביע על המרה של תאי האפיתל של המרה להפטוציטים לאחר אובדן הפטוציטים חמור.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לבחור כריתה מלאה לאחר הטיפול ב-MTT עבור התחדשות הכבד שלאחר מכן על פעולת ליזה לאחר התפתחותו. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום התחדשות הכבד לחקור את המנגנונים העומדים בבסיס אב הכבד, התחדשות כבד מונעת תאים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש במודל פעולה ספציפי זה של ציט גיאוגרפי למחקרי ניוון כבד מונע ביליו.