מערכת פשוטה לסלולרי הערכת Mechanosensing וDurotaxis במבחנה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לספק מערכת פשוטה לניתוח דורקס תאים שדרכה תאי יונקים רבים נודדים באופן מועדף לעבר מצע נוקשה יותר. זה מושג על ידי הכנה ראשונה של מצעי פולימתיל סובוקסן או PDMS בעלי קשיחות מוגדרת. לאחר מכן, ה- PDMS המוכן מוזג לכל באר של צלחת שש בארות וכל בועות האוויר מוסרות.

לאחר מכן, תאי Durex מושלמים על ידי הצבת החלקת כיסוי מעוקרת על גבי ה-PDMS בכל באר ליצירת שכבת-על. השלב האחרון הוא לזרוע תאים לתוך תאי המס של דורו בצפיפות שנותנת לתאים מספיק מקום לנדוד ללא אינטראקציות משמעותיות עם תאים אחרים. בסופו של דבר, מיקרוסקופ תאים חיים משמש לחקר אקססיס בתאים נודדים.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו פולי אקרילאמיד, הוא שיש שלב אחד בין ה-PDMS הרך לזכוכית קשיחה במקום חלופות ג'ל שיפוע. כמו כן ציפוי PDMS במטריצה חוץ-תאית רכיבים כמו פיברונקטין אינם דורשים קישור צולב כימי, הנדרש לג'לים פולי אקרילאמיד. כדי להכין תחילה צלחת תרבית רקמה אחת של שש בארות, קרעו את האיזון בעזרת צינור חרוטי של 50 מיליליטר.

שקלו כ-10 גרם מתמיסת הבסיס פולי דימתיל סובוקסן או PDMS בצינור של 50 מיליליטר. עבור מצע של 90 לאחד, חלקו את המשקל הנמדד של תמיסת הבסיס PDMS ב-90. כדי לקבוע את הכמות הנכונה של תמיסת הצלבה הדרושה, הוסף את הכמות המחושבת של תמיסת קרוסלינקר PDMS לתערובת הקרוסלינקר הבסיסית A-P-D-M-S המעורבת במרץ למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

בעזרת מרית קטנה בשלב זה, התערובת תכיל מספר קטן של בועות אוויר. צנטריפוגה את מצע ה-PDMS בצנטריפוגה ספסל למשך חמש דקות ב-50 פעמים. ז. הוסף את טמפרטורת החדר כדי להסיר את הבועות אם עדיין יש בועות.

לאחר חמש דקות הצנטריפוגה שוב פיפטה מיליליטר אחד של 90 למצע PDMS אחד לכל באר של תרבית הרקמה המטופלת. צלחת שש בארות. ניתן לחסל את כל בועות האוויר שנותרו ב-PDMS בשלב זה על ידי פיצוץ אותן עם מחט בגודל 21.

הניחו ל-PDMS להתפשט במשך 30 דקות בבאר. לאחר מכן מרתיחים 12 מילימטר מספר אחת, המכסה מחליק במים מזוקקים למשך חמש דקות, בסך הכל שלוש פעמים. הנח כיסוי מיובש אחד לכל באר של צלחת תרבית הרקמות על ידי נגיעה עדינה בצד אחד של המכסה.

החלק לתוך תמיסת ה-PDMS ולאחר מכן הפיל את החלקת הכיסוי על ה-PDMS. כאשר החלקת הכיסוי מתייצבת, ה-PDMS יתחיל לפלוש לשולי החלקת הכיסוי, אך לא יכסה אותה לחלוטין. זה ייצור ממשק בין ה-PDMS לזכוכית לאחר הריפוי.

דגרו את הצלחת בחום של 70 מעלות צלזיוס בתנור למשך 16 שעות כדי לרפא את ה-PDMS. לבסוף, הניחו את הצלחת במכסה המנוע של תרבית תאים ועיקרו UV למשך 10 דקות. יש לצפות כל תא דורוקס במיליליטר אחד של פיברונקטין במי מלח ללא סידן ומגנזיום למשך שעה אחת בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס.

ודא שכל המשטח שקוע בפיברונקטין בתמיסת PBS. הכן אלבומין סרום בקר 1% או BSA במשקל 0.5 גרם BSA והמסתו ב-50 מיליליטר של מסנן PBS. יש לעקר תמיסה דרך פילטר נקודתי של 22 מיקרון לפני חימום בחום של 80 מעלות צלזיוס למשך 12 דקות.

לאחר מכן, יש לשאוב את תמיסת הפיברונקטין ולשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS. הוסף מיליליטר אחד של BSA מפוגל בחום ב-PBS לכל באר ודגר במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, עיני טריפסין וספור את התאים לבחירתך בזמן שתאי הדורקס חוסמים עם החום. BSA מפורק שואב תמיסת BSA מהתאים ממש לפני הציפוי של תאים.

צלחת 10,000 תאים בנפח של שני מיליליטר לכל באר של תא הדואקס. באמצעות המדיום הנדרש לסוג התא המסוים שנבחר, אפשר לתאים להיצמד ולהתפשט על המצע במשך ארבע שעות באינקובטור לח ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2, לבצע הדמיית תאים חיים במיקרוסקופ הפוך באמצעות ניגודיות פאזה עם מטרה של פי 10. המיקרוסקופ צריך להיות מצויד בתא לחות סביבתי סגור, המאפשר שליטה בטמפרטורה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 במהלך הדמיה ארוכת טווח.

הדמיה, לאחר שהתאים התפשטו במשך כ -3.5 שעות, הרכיבו את הצלחת בתא המיקרוסקופ. אפשר לדגימות להתייצב בתא למשך 30 דקות. הגדר ביקור אוטומטי מרובה נקודות במיקרוסקופ אם זמין.

התמקד בממשק בין ה-PDMS להחלקת כיסוי הזכוכית ובחר נקודות לתמונה בכל רחבי הממשק. עם ממוצע של 40 נקודות לכל תמונת תא Durex, התאים כל 10 דקות למשך עד 16 שעות, אזור העניין יופיע כשני קווים כאשר הקו החיצוני מתאים לקצה החלקה של הכיסוי והקו הפנימי המתאים לממשק בפועל בין ה-PDMS לתלוש הכיסוי. כדי לנתח את הנתונים, צור גיליון אלקטרוני כמו זה שמוצג בפרוטוקול הטקסט.

ספרו את מספר אירועי המעבר מה-PDMS למשטח הזכוכית ולהיפך מכל סרט שנוצר. אירוע חצייה מוגדר כגרעין התא העובר מעל הגבול בין ה-PDMS לזכוכית בשני הכיוונים. רשום את מספר אירועי החצייה בעמודה המתאימה בגיליון האלקטרוני של Excel כדי לכמת מעברים מרובים.

ספור את מספר הפעמים שהתא חצה את הממשק. יש לרשום מספר זה בעמודת Excel המתאימה למצע שעליו ממוקם התא בסוף הסרט. חזור על הניתוח עבור כל תא שחוצה את הממשק בסרט.

אל תכלול תאים הנודדים אל מחוץ לשדה הראייה במהלך ההדמיה. חשב את אחוז התאים שנדדו מ-PDMS למשטח הזכוכית ולכן עברו דורו טקסס. לעשות זאת.

הוסיפו את מספר אירועי החצייה מרך לקשה ואת אירועי החצייה המרובים שהסתיימו בקשה וחלקו במספר הכולל של אירועי החצייה. חשב את אחוז המעברים המרובים על ידי חלוקת סך הכלאות מרובות במספר הכולל של הצלבות כדי להתחיל להבין את המנגנון המולקולרי שבאמצעותו תאים מתאימים לרמזים מכניים בסביבתם. ניתן להפיל חלבונים ספציפיים באמצעות IRNA כפי שמוצג כאן.

כ-70% מהתאים שטופלו ב-IRNA הפגינו axxis. בניגוד בולט, כאשר פער CD הופל באמצעות RNAi, לתאים לא הייתה העדפה אם הם נודדים למצע הקשה או הרך. יתר על כן, תאי הדפיקות של פער ה-CD חצו את מכפיל הגבול.

בעוד שתאי ביקורת שטופלו ב-irna בדרך כלל חוצים את הגבול רק לאחר מסלולי שליטה מייצגים. תאי אירנה מראים שהתאים בדרך כלל נודדים מעבר לגבול פעם אחת ומעדיפים להישאר על המשטח הנוקשה יותר בהשוואה לפער CD. אירנה טיפלה בתאים שלא הראו העדפה לקשיחות וחצו את הגבול מספר פעמים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין את מצעי ה-PDMS, להרכיב את תאי הדוריס ולכמת מיסי DUR.