Microdialysis Probe עיצוב מותאם אישית
21 ביולי 2015
Microdialysis היא טכניקה נפוץ במחקר מדעי מוח. לכן בדיקות מסחריות נמצאות בdemand.In הגדול עבודה זו הרכבה בדיקה הוא הסבירה בפירוט לבנות חללית אמינה, קונצנטריים, מחוייט microdialysis פחות מ 10 $.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לתאר את היצרן של בדיקת מיקרודיאליזה בהתאמה אישית. זה מושג על ידי חיתוך ראשון של צינורות פוליטטרפלואורואתילן והתמזגות סיליקה למידות הנכונות. השלב השני הוא הכנסת הסיליקה המותכת לתוך הצינור באמצעות צינורית כהנחיה.
לאחר מכן, קרום דיאליזה ממוקם מעל הסיליקה המותכת. השלב האחרון הוא למשוך את שרוול המתכת אל החלק הנותר של הסיליקה המותכת ולהשתמש באפוקסי כדי לסגור מפרקים ולהבטיח אורך החלפה של שני מילימטרים. בסופו של דבר, ההוראות בסרטון זה יראו כיצד לבנות בדיקת מיקרודיאליזה יציבה ואמינה בהתאמה אישית כחלופה לבדיקה מסחרית, שיכולה למדוד במדויק התאוששות במבחנה של נוירופפטידים ומולקולות קטנות.
היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להתאים את מכלול בדיקת המיקרודיאליזה המוצג בפירוט לכל יישום וניתן לייצר אותו בפחות מ-10. כדי להתחיל, חותכים חתיכה של צינור פוליטטרפלואורואתילן בעובי 1.6 מילימטר בקוטר פנימי של 350 מיקרון לקטעים באורך 2.5 סנטימטר. חותכים קצה אחד של הקטע בזווית של 45 מעלות על מנת להקל על חיבור צינור היציאה.
לאחר מכן, השתמש בנייר זכוכית כדי לחספס את המשטח החיצוני של צינור ה-PTFE כדי לקדם הידבקות של דבק אפוקסי. חותכים קטע של סיליקה התמזגה לחתיכה באורך 2.25 סנטימטר. הכנס מחט בגודל 30 לתוך סיב ה-PTFE החלול סנטימטר אחד מהקצה השטוח.
כופפו את ה-PTFE ונקבו את הנדן בעיקול. הכנס את הסיליקה המותכת לתוך צינור ה-PTFE באמצעות צינורית המחט כהנחיה. לאחר מכן הסר בעדינות את צינורית המחט ומקם את הסיליקה הממוזגת כך שחמישה מילימטרים מקרינים החוצה את הקצה השטוח של צינור ה-PTFE.
השתמש בטיפת דבק ציאנואקרילט כדי להדק את הסיליקה המותכת במקומה במקום הניקוב ולאפשר לה להתקשות למשך הלילה. הכן את דבק האפוקסי על ידי הוספת 30 חלקים של מקשה צהוב ל -70 חלקים של דבק אפוקסי שחור וערבוב עדין. לאחר מכן משוך קרום דיאליזה פוליסולפון חיתוך של 30 קילו-דלטון בקוטר פנימי של 210 מיקרון וקוטר חיצוני של 245 מיקרון.
בזהירות מעל הסיליקה ההתמזגה. משוך את הממברנה לתוך צינור ה-PTFE והתאם את הממברנה ל-5.5 מילימטרים באמצעות אזמל חד. סמן נקודה על הממברנה בעזרת עט עדין כדי להגדיר את אורך ההחלפה של שני מילימטרים מקצה הממברנה.
לאחר מכן השתמש במחט דקה כדי למרוח כמות קטנה של דבק אפוקסי כדי לכסות את קצה הממברנה. לאחר מכן, השתמש בדבק אפוקסי כדי לסגור את המפרק בין קרום הדיאליזה לסיבי ה-PTFE. כעת חזור והוסף מספיק דבק אפוקסי על הממברנה עד לנקודת הסימון.
כדי להבטיח אורך חילופי דיפוזיה של שני מילימטרים בלבד, אפשר לדבק האפוקסי להתקשות בן לילה. השתמש בזוג צבת כדי לשבור בזהירות חתיכות סנטימטר אחד של מחט בגודל 25 על מנת ליצור שרוולי מתכת. לאחר מכן משוך את שרוול המתכת אל החלק הנותר של הסיליקה המותכת והשתמש בדבק האפוקסי שנותר כדי לאטום את המפרק בין שרוול המתכת לצינור ה-PTFE.
שרוול המתכת מאפשר מאוחר יותר את חיבור צינור הכניסה עם בדיקת מיקרודיאליזה. לבסוף, יש למרוח דבק חם סביב התפצלות הגשושית לקיבוע וייצוב נוסף של המכשיר. סכימה זו מציגה תקריב של פעולתה הפנימית של בדיקת המיקרודיאליזה.
שני מילימטרים מקרום הדיאליזה של פוליסולפון נחשפים בקצה הבדיקה, מה שמאפשר התאוששות של מטבוליטים קטנים במשקל מולקולרי כמו גלוקוז, TP ואצטילכולין. היכולת של הגשושית לשחזר מולקולות קטנות במשקל מולקולרי נמוך כמו גלוקוז, לקטט, אצטילכולין ו-TP במבחנה מוצגת כאן. אחוז ההתאוששות גבוה בהרבה עם מולקולות אלה, שהן בסביבות 500 דלטון מאשר מולקולות גדולות יותר כמו אנגיוטנסין 2, חומר p וסומטוסטטין, שהן מעל 1000 דלטון.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבנות בדיקות מיקרודיאליזה יציבות ואמינות כחלופה למסחריות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר את תהליך הייצור של גשש מיקרודיאליזה בהתאמה אישית, המהווה חלופה חסכונית לגששים מסחריים. הפרוטוקול מפרט את השלבים הדרושים ליצירת גשש אמין המסוגל למדוד נוירופפטידים ומולקולות קטנות in vitro.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- טכניקות מיקרודיאליזה
- ייצור גששים
רקע
- מיקרודיאליזה נמצאת בשימוש נרחב במחקרים בתחום מדעי העצבים.
- קיים ביקוש גבוה ל probes של מיקרודיאליזה שיהיו אמינים.
- פרוbes המיוצרים בהתאמה אישית עשויים להיות משתלמים יותר מאפשרויות מסחריות.
- הבנת אופן הבנייה של probes אלו יכולה לשפר את יכולות המחקר.
מטרת המחקר
- מתן הוראות מפורטות לבניית גששת מיקרודיאליזה מותאמת אישית.
- הצעת חלופה משתלמת לגששות מסחריות.
- הבטחת מדידה מדויקת של נוירופפטידים ומולקולות קטנות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- חיתוך צינורות polytetrafluoroethylene וסיליקה מותכת לממדים ספציפיים.
- החדרת סיליקה מותכת אל תוך הצינור באמצעות קנולה להכוונה.
- מיקום ממבקר דיאליזה מעל הסיליקה המותכת.
- אבטחת המכלול באמצעות שרוול מתכת ואפוקסי להבטחת עמידות.
תוצאות עיקריות
- ניתן להרכיב גשושית מיקרודיאליזה מותאמת אישית, אמינה וחסונה.
- הגשושית מסוגלת למדוד במדויק התאוששות (recovery) של נוירופפטידים in vitro.
- העלות הכוללת של הרכבת הגשושית היא פחות מ-$10.
מסקנות
- פרובים למקור-דיאלזה מותאמים אישית הם חלופה ישימה לאפשרויות המסחריות.
- הוראות מפורטות יכולות להעניק לחוקרים את היכולת ליצור פרובים משלהם.
- שיטה זו יכולה לשפר את הנגישות של טכניקות מיקרודיאלזה במחקרים במדעי העצבים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ייצור עצמאי של סונדות מיקרודיאליזה מציע פתרון חסכוני למחקר במדעי העצבים, המאפשר ניטור מדויק של דינמיקה נוירוכימית בנוזל החללי (cerebrospinal fluid). באמצעות הפחתת עלויות הסונדות לסכום הנמוך מ-10$, שיטה זו משפרת את הנגישות עבור מוסדות ציבורית ותומכת בפריסה רחבה במחקרי קליניקה טרום-ממסדיים. גישה זו מקלה על תיקוף יעדים (target validation) והסרת סיכונים מכניסטיים על ידי אספקת נתוני התאוששות מהימנים עבור מולקולות קטנות ונוירופפטידים, ובכך מסייעת בקבלת החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) בשלבי גילוי מוקדמים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות השחזור הכמותי של גלוקוז, לקטט, אצטילכולין, ATP ונוירופפטידים בטווח של 100-1,600 Da.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי אספקת מדדי השחזור הניתנים לשחזור in vitro (כ-20% עבור מולקולות קטנות, 2-6% עבור נוירופפטידים) להבהרת המעורבות של המטרה (target engagement) והמודולציה של המסלול.
- ערך חיזוי: מייצר תובנות מכניסטיות המשפרות את תעדוף הפורטפוליו על ידי בידול השפעות התרכובות בהתבסס על משקל מולקולרי ותכונות פיזיקו-כימיות.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- ערך מדעי: מכין מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף עבור תהליכי עבודה המשכיים (downstream) באמצעות התקנת ממבנה דיאליזה בעל סף חיתוך מולקולרי מוגדר (30 kDa) ואורך חילוף (2 mm).
- ערך תפעולי: מקדם סטנדרטיזציה של הבדיקה ושחזוריות באמצעות ממדי גשושית עקביים וביצועי ממבנה אחידים בין מחלקות שונות של חומרים.
- סקילביליות: מאפשר שימוש חוזר בפלטפורמה והתאמה לאורכי חילוף גדולים יותר עבור מודלים שונים של בעלי חיים, ובכך תומך במוכנות לסריקה בסביבה של תפוקה גבוהה (high-throughput screening).
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מקשרת בין מדידות נוירוכימיות משלב הגילוי לוולידציה פרה-קלינית באמצעות ניטור חומרים הרלוונטיים לפתולוגיה של המחלה.
- קידום מותאם סיכון: מספקת בסיס להחלטות go/no-go פרה-קליניות באמצעות נתוני התאוששות כמותיים המשקפים את חדירות מחסום הדם-מוח ואת נגישות המטרה.
- התאמה של סמנים ביולוגיים: תומכת בפיתוח סמנים ביולוגיים תרגומיים על ידי מתן אפשרות לגילוי נוירופפטידים ומטבוליטים בנוזל החוץ-תאי.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות ועד לזיהוי מובילים (lead identification), ומספקת מדדים נוירוכימיים כמותיים התומכים בהבנה מכניסטית ובתעדוף תרכובות.
- ביולוגיה של גילוי: מקלה על בדיקת השערות והבהרת מסלולים באמצעות מדידה של התאוששות in vitro של מוליכים עצביים ומטבוליטים אנדוגניים.
- סריקה: מספקת מערכות מוכנות לבדיקה עם תוצאות הניתנות לשחזור להערכת השפעות של תרכובות על שטף נוירוכימי.
- אנליטיקה: מספקת מדידות כמותיות של משתנים תלויים (אחוזי התאוששות) המאפשרות השוואה בין תנאים שונים וניתוח של קשר מבנה-פעילות.
- מחקר תרגומי: מגשר בין שלב הגילוי לעבודה פרה-קלינית על ידי הפקת נתונים הרלוונטיים למעורבות המטרה במערכות הרלוונטיות למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת יכולת ניטור נוירוכימי ניתנת לשימוש חוזר, שניתן להתאימה לפרויקטים ומערכות מודל שונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת עמימות מכניסטית באמצעות מדידה נוירוכימית ישירה.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה, הדירות ויכולת הרחבה באמצעות הרכבת גששים בעלות נמוכה הניתנים להתאמה אישית.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך התהליך (go/no-go) ואת יעילות ההון על ידי מתן אפשרות להפחתת סיכונים ביולוגית מוקדמת בשלב הגילוי.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בסדרי עדיפויות מותאמי סיכון באמצעות נתוני התאוששות מהימנים המנחים את קריטריוני ההתקדמות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בעקרונות המיקרודיאליזה, טיפול בממברנות וטכניקות הדבקה.
- נדרש ציוד לחיתוך מדויק (סקלפל, פלייר), הכנת שטח פנים (נייר זכוכית) והקשיה (אפוקסי למשך הלילה/דבק חם).
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של ממדי הגשש, אורך החילוף והכנת הממברנה להשגת תוצאות הדירות.
- כולל שיקולי התאמה עבור סף משקל מולקולרי (molecular weight cut-off) שונה, חומרי ממברנה ואורכי חילוף במערכות מודל שונות.
- כולל מגבלות מעשיות כגון זמן הרכבה ידני, הדירות התלויה במיומנות הצוות והצורך בתיקוף in vitro עבור כל סדרה.
