דגם רקמות 3D ריאות אדם ללימודים פונקציונליים ב חפת Mycobacterium זיהום

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבנות מודל רקמת ריאה במבחנה למחקרים על זיהום שחפת M. זה מושג על ידי שכבת מטריצת קולגן פיברובלסטים על המסנן של תוספת צלחת תרבית תאים. בשלב השני, תאי אפיתל חיסוני וריאות נגועים יושבים על שכבת הקולגן הפיברובלסטים.

לאחר מכן, מודל הרקמה התלת-ממדי המתקבל נחשף לאוויר כדי להקל על הפרשת הריר והריבוד של האפיתל. בשלב האחרון, הרקמה נקצרת ומורכבת. בסופו של דבר, מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית משמשת לניתוח היווצרות גרנולומה מוקדמת הנגרמת על ידי שחפת M.

היתרון העיקרי של טכניקה זו או שיטות קיימות, כגון שכבה חד-פעמית של תאים במבחנה, הוא שהתאים במערכת זו נמצאים במיקרו-סביבה תלת מימדית, המאפשרת היווצרות גרנולומות עם זיהום במיקרובקטריות אלימות הדומות לשחפת אנושית כדי להכין פיברובלסטים משובצים בקולגן התחל בטיפול בתאי פיברובלסטים ריאתיים עם טריפסין למשך 10 דקות ב-37 מעלות צלזיוס כאשר התאים התנתקו, עצרו את התגובה עם שמונה מיליליטר של DMEM מלא ואז סובבו את התאים. השעו מחדש את הכדורים ב-230,000 תאים למיליליטר ב-dmm טרי והניחו את התאים על קרח. לאחר מכן, הוסף תוספת אחת לכל באר לשישה.

ובכן צלחת והוציאו מיליליטר אחד של תערובת שכבות סלולריות טריות שהוכנו לכל תוספת, וודאו שהתערובת מכסה את כל התוספת ללא בועות אוויר. לאחר מכן מניחים את הצלחת בחממה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. בתום הדגירה מערבבים שני מיליליטר קולגן עם 615 מיקרוליטר פרמיקס בצינור חרוטי סטרילי על קרח כדי לנטרל את ה-pH של הקולגן בכל תוספת.

לאחר מכן הוסיפו לתערובת הקולגן 58 מיקרוליטר של dmem מלא ו-327 מיקרוליטר של פיברובלסטים ריאתיים לכל תוספת. צנרת למעלה ולמטה כדי לפזר את התאים באופן שווה בכל התערובת. כעת הוסיפו במהירות שלושה מיליליטר מהשכבה התאית לאורך כל תוספת לכל שכבת קולגן א-תאית.

הקפידו להימנע מבועות אוויר ולהחזיר את הצלחת לחממת תרבית התאים למשך שעתיים נוספות. לאחר פילמור הקולגן, הוסיפו שני מיליליטר של דמם שלם לתחתית כל באר, והחזירו את הצלחת לחממה למשך 24 שעות נוספות. למחרת, השתמש בזוג מלקחיים נקיים כדי להרים בזהירות את התוספות בזה אחר זה ולשאוף את מדיום התרבות מתחתית כל אחד מהם.

ובכן, הוסף שני מיליליטר של DMM שלם לתחתית כל באר, ושני מיליליטר של DMM שלם לכל תוספת. החלפת שני נפחי המדיום כל יומיים למשך חמישה עד שבעה ימים. כדי להכין את המקרופאגים הנגועים, התחל בדגירת תרבית מקרופאגים למשך ארבע שעות עם שחפת M אלימה בריבוי זיהום של 10.

בתום הדגירה יש לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS כדי להסיר את החיידקים החוץ-תאיים ולטפל במקרופאגים בשתי מילי-מולר, DTA למשך 10 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. כאשר התאים ניתקו את הרסוס, השעו אותם ב-dmm מלא ללא אנטיביוטיקה. לאחר מכן שאפו את כל המדיום מלוח מטריצת הקולגן הפיברובלסטים והוסיפו 1.5 מיליליטר של DMM שלם ללא אנטיביוטיקה טרי לתאים החיצוניים.

לאחר מכן, ערבבו מונוציטים עם תווית פלואורסצנטית עם המקרופאגים הנגועים ביחס של חמישה לאחד ב-50 מיקרוליטר של DM EM מלא ללא אנטיביוטיקה לכל תוספת. לאחר מכן הוסיפו 50 מיקרוליטר מתערובת המקרופאגים המונוציטים לחלק הפנימי של כל תוספת והחזירו את הצלחת לחממה. לאחר שעה, הוסיפו לאט לאט שני מיליליטר תרבית, מדחסו את דפנות התוספות כדי למנוע עקירת התאים ודגירת התרבויות למשך 24 שעות נוספות.

כדי לזרוע את התרביות עם תאי אפיתל ריאה, הוסף 4 מיליון תאי אפיתל למיליליטר ב-50 מיקרוליטר של dmm מלא על גבי מטריצות הקולגן הפיברובלסטים של תאי החיסון. דגרו על התאים במשך שתי דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן שעה אחת בטמפרטורת 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן הוסיפו בעדינות שני מיליליטר של DMM מלא ללא אנטיביוטיקה לתוספות כפי שהודגם זה עתה, ותרבו את התאים למשך שלושה ימים נוספים.

חמישה ימים לאחר הזריעה המקרופאגים הנגועים שואבים את כל מצע התרבית מהצלחת ומוסיפים 1.8 מיליליטר של DMM מלא ללא אנטיביוטיקה לתאים החיצוניים. לאחר מכן האוויר חשף את דגמי הרקמה התלת-ממדית באינקובטור למשך יומיים מבלי להוסיף מדיום לתוספת ביום השביעי. לאחר הזריעה.

הסר את המדיום לחלוטין מהצלחת וערבב את דגמי הרקמות עם 4% פרלדהיד למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. לאחר מכן בעזרת אזמל, הפרד את הממברנות ממוסיף הבאר. לאחר מכן, השתמש באזמל נקי כדי להסיר בזהירות את דפנות דגמי הרקמות ולפרוש כל רקמה לארבע חתיכות מרובעות שוות בגודלן.

מעבירים את החלקים למגלשות זכוכית סופר פרוסט ונותנים להם להתייבש במשך חמש דקות. לאחר מכן באמצעות הרכבה פלואורסצנטית, מדיום המכיל אנטי דהייה ו-dpi, הרכיבו את הרקמות וכסו אותן בהחלקות כיסוי. השאירו את השקופיות בטמפרטורת החדר בחושך עד שהן יבשות, ואז אטמו את שולי החלקת הכיסוי בעזרת לק.

כאשר הלכה מיובשת, טבלו את המגלשות באתנול 70% להעברה ממתקן BSL 3. כדי לדמיין את הרקמות, רכשו תמונות תלת מימד של חמישה עד 10 שדות שונים המכסים את כל פיסת הרקמה ברזולוציה של 512 על 512 כאשר זאק מכסה בעובי מינימלי של 20 מיקרון עם הפרדה של 1 עד 1.5 מיקרון בין הערימות במיקרוסקופ קונפוקלי פלואורסצנטי לכימות תלת מימדי של אשכולות התאים. פתח את תוכנת עיבוד התמונה התלת מימדית וטען את התמונה המעניינת.

לאחר מכן, בעזרת כלי התאמת התצוגה, התאימו כל אחד מהערוצים לתמונה, לניגודיות, לבהירות ולאטימות המיזוג כדי למטב את עיבוד עוצמת הקול ולמזער את הפרעות הרעש. לאחר מכן כדי לדמיין את פני הרקמה, בחר את תעלת המונוציטים האדומה והגדר את הספים המתאימים באמצעות המסננים כדי להגביל את בחירת המונוציטים האדומים או לא לכלול את הרקע לפי הצורך. לבסוף, ייצא את הנתונים לתוכנית הגיליונות האלקטרוניים המתאימה להמשך ניתוח במורד הזרם.

ביום השביעי, מיקרוסקופ קונפוקלי של זרעי תאים נגועים בשחפת לאחר M חושף אשכול של מונוציטים אדומים באתר ההדבקה, כפי שצוין על ידי נוכחות החיידקים הירוקים המחקים את הנגעים של שחפת אנושית המכונה גרנולומה 3D. הדמיה מספקת את הגמישות של אינטראקציה, בחינה וכימות של מספר תכונות. תמונה תלת מימדית, למשל, בתמונות אלה המתארת מקבץ של מונוציטים באתר של שחפת.

ניתן לראות את הסידור המרחבי של חיידקים ירוקים ואשכולות מונוציטים אדומים מהתצוגה האפיקלית, הסיבובית והרוחבית. כצפוי, אשכולות אלה לא נצפו ברקמות הלא נגועות. כימות הגודל והמספר של מונוציטים, אשכולות תאים ורקמות נגועות בשחפת M גילה כי גודל אשכולות התאים גדל בעוד שמספר המונוציטים הבודדים יורד בהשוואה למודלים של רקמות לא נגועות.

משתמשים פוטנציאליים במודל רקמת ריאה זה כוללים מחקר על תפקידם של תאי חיסון שונים וחסינות רקמות בשחפת, חקר פנוטיפים של מיקובקטריות ובדיקת מועמדים לתרופות שהורגות מיקובקטריות בתוך הגרנולומה.