ניתוח של פיתוח שיניים נבט עצבוב שימוש בהתקני Microfluidic משותף התרבות
14 באוגוסט 2015
תרביות משותפות מייצגות שיטה רבת ערך לחקר האינטראקציות בין עצבים לרקמות ואיברי מטרה. מערכות מיקרופלואידיות מאפשרות תרבית משותפת של גנגליונים ואיברים או רקמות מתפתחים שלמים במצעי תרבית שונים, ובכך מייצגות כלי רב ערך למחקר במבחנה של הדיבור בין נוירונים למטרותיהם.
המטרה הכוללת של הליך זה היא להראות כיצד לבודד ולתרבית משותפת את הגרעינים הטריגמינליים וחיידקי השיניים המתפתחים. זה מושג על ידי עיקור, הרכבה וציפוי ראשונים של המכשירים המיקרופלואידיים. השלב השני הוא לנתח גרעיני טריגמינל וחיידקי שיניים משלב התפתחותי ספציפי בעכבר המעניין.
לאחר מכן, הגרעינים הטריגמינליים וחיידקי השן מוכנסים למכשירים המיקרופלואידיים ומתרבתים במשותף. השלב האחרון הוא לתקן את התאים ולהכתים אותם באמצעות אימונופלואורסצנטיות. בסופו של דבר, מיקרוסקופיה משמשת כדי להראות את דפוס העצבוב שהוא תוצאה של תרבית משותפת.
היתרון העיקרי של טכניקה זו של שיטות קיימות, כמו תרביות קו-קונבנציונליות, הוא ששיטה זו מאפשרת תרבית משותפת של איברים ורקמות שונות כל אחד בתרבית האופטימלית שלו. בינוני. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום החדשנות המלאכותית, כגון תפקידן של מולקולות שונות בחדשנות בשיניים וכלל החדשנות בהתפתחות השיניים. התחל בחיטוי כלי דיסקציה, הכוללים זוג מלקחיים מיקרו-דיסקציה וזוג מספריים.
לאחר מכן, יש לעקר אצווה של החלקות כיסוי זכוכית בגודל 24 מילימטר על 24 מילימטר על ידי הנחתן בתמיסה של חומצה הידרוכלורית מולרית אחת על שייקר אורביטלי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. לאחר מכן שטפו את החלקות הכיסוי שלוש פעמים במים מזוקקים סטריליים, ולאחר מכן שלוש שטיפות באתנול 99%, יבשו אותם מתחת לקולט אדים סטרילי לאחר הייבוש, הדליקו את אור ה-UV של מכסה המנוע למשך 30 דקות. לאחר מכן אחסן את פתקי הכיסוי באתנול 70% עד שהם נחוצים.
לאחר מכן, השתמשו במלקחיים סטריליים כדי להסיר בזהירות את המכשירים המיקרופלואידיים של בידוד האקסון מאריזתם ולהניח אותם בצלחת פטרי סטרילית באמצעות אגרוף ביופסיה סטרילי של מילימטר אחד. צור חור אחד במכשירים עבור כל דגימה. בהתכתבות של חדרי התרבות.
היזהר לא לנקב קרוב מדי לחריצי המיקרו מכיוון שהם עלולים להינזק מהלחץ. לאחר מכן, עקר את המכשירים על ידי הופעתם באתנול של 70%. דואגים להסיר את כל האוויר הכלוא.
לאחר מכן הסר את המכשירים מהאתנול וייבש אותם לחלוטין מתחת למכסה המנוע סטרילי. כמו כן, הסר את החלקות הכיסוי מתמיסת האתנול 70% ותן להן להתייבש מתחת למכסה המנוע הסטרילי. המתן לפחות שלוש שעות לפני שתמשיך.
מניחים כל כיסוי לבאר בתוך צלחת שש בארות. לאחר מכן הנח את המכשיר המיקרופלואידי על החלקת הכיסוי ולחץ בעדינות אך בחוזקה עם המלקחיים על מנת לאפשר הידבקות מלאה בין מכשיר הבידוד להחלקת מכסה הזכוכית. לאחר מכן, פיפטה 150 מיקרוליטר של 0.1 מיליגרם למיליליטר, פולי D ליצין לכל אחד מתאי התרבות.
לאחר מכן הנח את המכשירים המיקרופלואידיים תחת ואקום למשך חמש דקות כדי להסיר את כל האוויר מהתאים. אם עדיין ניתן לראות אוויר בתוך התאים. החזר את תמיסת הפולי D ליזין לתאים.
דגרו את המכשירים עם פולי דה ליזין למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למחרת. שטפו את התאים שלוש פעמים במים מזוקקים סטריליים, ולאחר מכן מלאו את התאים ב -150 מיקרוליטר של חמישה מיקרוגרם למיליליטר, תמיסת עבודה למין, ודגרו אותם למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, אמצעי תיקון עבור הגרעינים הטריגמינליים ותרביות נבט השיניים כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה.
נקה את אזור הדיסקציה ואת הסטריאוסקופ עם אתנול 70% והנח את מכשירי הדיסקציה לאחר ההקרבה. נתח את העור סביב הבטן התחתונה של עכברה בהריון עם עוברי עכבר בשלב E 14.5 עד E 17.5. ואז פתח בזהירות את הבטן בעזרת מספריים.
אתר את הרחם, הסר אותו והנח אותו בצינור מלא בקרח. PBS קר מנתח את העוברים ומניח אותם בנפרד בצלחת פטרי חדשה מלאה ב-PBS קר כקרח. לאחר שכל העוברים הוסרו מהרקמות העובריות הנוספות, ערפו את ראשיהם באמצעות מספריים.
הפרד את הלסת התחתונה משאר הראש באמצעות דיסקציה מיקרו, מספריים, תוך הקפדה לא לפגוע בגרעינים הטריגמינליים. לאחר מכן, קח את הראש והניח אותו על צלחת פטרי מזכוכית צוננת. השתמש במלקחיים כדי להסיר את העור והגולגולת.
לאחר מכן הניחו מלקחיים מתחת לקפלון והרימו. כדי להסיר את הצפלון והמוח הקטן, מקם את הגרעינים הטריגמינליים והשתמש במלקחיים ובמחטי הדיסקציה כדי להפריד את הגרעינים הטריגמינליים מהעצבים הטריגמינליים ולנקות את הגרעין. שמור אותם ב- PBS קר באמצעות מחטי דיסקציה כסכינים.
הסר את הלשון ואת העור המקיף את הלסת. הפרד את לסת המי השמאלית והימנית על ידי חיתוך לאורך קו האמצע של הלסת. לאחר מכן אתר את חיידקי השיניים ובודד אותם באמצעות מחטי דיסקציה לאחר דיסקציה של הגרעינים הטריגמינליים וחיידקי השן, הסר את הלמינין מהמכשירים המיקרופלואידיים ומלא את התאים ב-200 מיקרוליטר של המדיה המתאימה.
בעזרת מלקחיים, העבירו בעדינות את הגרעינים הטריגמינליים וחיידקי השיניים המנותחים לתוך החורים שנוצרו באמצעות אגרוף ביופסיה. ודא שחיידקי השיניים אינם צפים ושהם שוקעים עד שהם באים במגע עם החלקות הכיסוי. תרבית, הדגימות בחממה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני.
שנה את מדיום התרבות כל 48 שעות למשך 10 ימים כדי לשנות את המדיום. ראשית, הסר את המדיום על ידי הפניית הפיפטה לכיוון הצד החיצוני של הבארות. לאחר מכן מוסיפים את המדיום הטרי והחם בצד הוולס הממוקם מול התאים בתקופת התרבות.
דמיין את תרביות הקו בכל עת באמצעות מיקרוסקופ אור. לאחר תקופת התרבות, יש לשטוף את התאים על ידי פיפטינג של 150 מיקרוליטר PBS לבאר אחת לכל תא, ולתת ל- PBS לזרום דרך התאים. חזור על הכביסה בסך הכל שלוש פעמים לאחר הכביסה האחרונה.
הסר את ה-PBS וקבע את הדגימות על ידי פיפטינג של 150 מיקרוליטר של 4% אלדהיד פרפורמי ב-PBS לבאר אחת לכל תא, ואפשר לו לזרום לתא השני. דגרו את המכשיר בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. לאחר מכן שטפו את התאים פעמיים עם PBS והמשיכו בניתוח נוסף כגון צביעה אימונו-פלואורסצנטית והדמיה של הצמיחה.
במהלך תרבית פחם, נויריטים מהגרעינים הטריגמינליים מסתעפים מתא התרבות שלו ומתרחבים לעבר נבט השן המתפתח. בהגדלה גבוהה יותר, אפשר לראות את הנויריטים משתרעים דרך החדרים האקסונליים ואת החריצים הזעירים במכשיר המיקרופלואידי. ניתן לעקוב אחר התקדמות צמיחת העצבים לאורך זמן כדי לתאר את התפתחות החדשנות.
בעקבות הליך זה ניתן לבצע שיטות נוספות כמו RNA או PROTEINIZATION על מנת לחקור, למשל, שינויים בביטוי גנים או הפרשת חלבונים ברקמות המטרה בעקבות חדשנות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מדגים שיטה לבידוד ולתרבית משותפת (co-culture) של גנגליונים טריגמינליים מתפתחים ונבטי שן באמצעות התקנים מיקרופלואידיים. גישה זו מאפשרת לחקור אינטראקציות עצביות עם רקמות מטרה בסביבה מבוקרת.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביולוגיה התפתחותית
- מיקרופלואידיקה
רקע
- תרביות משולבות (Co-cultures) חיוניות לחקר אינטראקציות בין עצב למטרה.
- מערכות מיקרופלואידיקה מאפשרות שיתוף-גידול (co-culturing) של רקמות שונות.
- הבנת דפוסי העצבוב חיונית למחקרים התפתחותיים.
- שיטה זו מספקת תובנות לגבי התפתחות נוירונלית ואינטראקציות בין רקמות.
מטרת המחקר
- לבידוד ולגידול משותף (co-culture) של גנגליונים תריגמינליים ונבטי שיניים.
- לחקירת התקשורת ההדדית (crosstalk) בין נוירונים לבין הרקמות המטרה שלהם.
- להדמיה של דפוסי העצבוב באמצעות מיקרוסקופיה.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- עיקור וציפוי של התקני מיקרופלואידיקה.
- הוצאה של גנגליונים תריגמינליים ונבטי שיניים מעוברי עכבר.
- הנחת רקמות בתוך התקני מיקרופלואידיקה לתרבית משותפת (co-culture).
- קיבוע וצביעה אימונופלואורסצנטית של תאים.
תוצאות עיקריות
- תרבית משותפת מוצלחת של גנגליות טריגמינליות ונבטי שן.
- ויזואליזציה של דפוסי העצבבה העצבית.
- הדגמה של האינטראקציות בין עצבים לרקמות מטרה.
- תובנות לגבי התהליכים ההתפתחותיים של מיקום עצבי המטרה.
מסקנות
- תרביות שיתוף (co-cultures) מיקרופלואידיות יעילות לחקר אינטראקציות נוירונליות.
- שיטה זו יכולה לקדם את ההבנה של התפתחות עצבים.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על ממצאים אלו כדי לחקור אינטראקציות בין רקמות אחרות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך ניהולי
הבנת האינטראקציות בין עצבים לרקמות המטרה היא קריטית להפחתת סיכונים בהשערות של ביולוגיה התפתחותית בתהליכי גילוי תרופתי. שיטת השיתוף-תרביתי (co-culture) במיקרופלואידיקה זו מאפשרת מחקרים מבוקרים וארוכי טווח של דפוסי עיצוב עצבי (innervation), ותומכת בתיקוף מכניסטי במודלים של אורגנוגנזה. גישה זו מספקת פלטפורמה הניתנת לשחזור להערכת מתווכים מולקולריים של התפתחות רקמות, עם רלוונטיות ישירה לתהליכי תיקוף של מטרות ותהליכי סריקת פנוטיפית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר חקירה של ההשפעה העצבית על המורפוגנזה ובידול התאים של נבט השן.
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף תפקודי של מטרות על ידי בידוד האינטראקציה בין העצב לרקמה בסביבה מיקרוסקופית מוגדרת.
- ערך ניבוי: מסייע בהערכה של מתווכים מולקולריים (למשל, רמזי הדרכה, גורמים טרופיים) המודולפים את מסלולי ההתפתחות.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מוכנות הבדיקה: מבסס מערכת שיתוף-תרבית (co-culture) סטנדרטית לניתוח כמותי של צמיחת ניוריטים ותגובת רקמות.
- שחזוריות: שומר על חיוניות רקמה יציבה ועל דפוסי עיצוב עצביים טבעיים לאורך תקופות תרבית ממושכות (עד 10 ימים).
- מדרגיות: תואם לריבוי-מיקרופלואידקה (microfluidic multiplexing) לבדיקה מקבילה של תנאים במסגרת גילוי תרופות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מדמה תהליכים התפתחותיים רלוונטיים להפרעות מולדות המשפיעות על ההתפתחות הקרניו-פציאלית והעצבית.
- המשכיות תרגומית: מגשר בין תובנות מכניסטיות משלב הגילוי לבין תיקוף פרה-קליני של התחדשות רקמה התלויה בעצב.
- הפחתת סיכונים: מפחיתה את העמימות במנגנון המטרה על ידי מתן אפשרות לצפייה ישירה בהשפעה העצבית על אינטראקציות אפיטליאליות-מזנכימליות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
השיטה משתלבת בתהליכי גילוי מוקדמים על ידי אספקת מערכת מבוקרת לתיקוף מטרות נוירונליות לפני מאמצים לזיהוי מולקולות מובילות.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת היפותזות על תפקידן של מולקולות ספציפיות בהתפתחות רקמות המודרכות על ידי עצבים.
- סריקה: מייצר פלטי דימות כמותיים (מסלול נוריטים, צפיפות התבסעות) לצורך ניתוח של תרכובות או הפרעות גנטיות.
- אנליזה: מאפשר קריאות מורפומטריות ומבוססות פלואורסצנציה להשוואת תנאים ניסיוניים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין מנגנונים התפתחותיים לבין אסטרטגיות רגנרטיביות בהנדסת רקמות קרניו-פציאליות.
- שימוש חוזר ארגוני: פלטפורמה הניתנת להתאמה לזוגות אחרים של נוירונים ורקמות מטרה (למשל, גנגליונים סימפתטיים ולב, עצבים אנטריים ומעי).
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי במנגנוני מטרה על ידי הפחתת ההסתמכות על מודלים ניסיוניים של in vivo.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של תנאי תרבית משותפת (co-culture), הממזערת שונות הנובעת ממגאלות סרום או מחוסר תאימות של מצעי גידול.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך או עצירה (go/no-go) באמצעות אספקת ראיות ישירות למעורבות המטרה במסלולי פיתוח.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של מטרות מותאם סיכון, בהתבסס על נתונים מאומתים של אינטראקציה בין עצב לרקמה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול במכשירים מיקרופלואידיים, בניתוח רקמות סטרילי ובמיקרוסקופיית אימונופלואורסצנציה.
- תלוי בגישה למקורות של רקמות עובריות ובתשתית תרבית סטרילית (אינקובטור CO2, מCב מזרם למינרי).
- מחייב סטנדרטיזציה של פרוטוקולי ציפוי ב-poly-D-lysine ובלמינין להבטחת היצמדות עקבית לפני השטח.
- התאמה למערכות רקמות אחרות עשויה לדרוש אופטימיזציה של גיאומטריית התא והרכב המדיום.
- מגבלות מעשיות כוללות סיכון לסתימה של המכשיר והצורך בהחלפת מדיום מבלי להפר את מיקום הרקמה.
