זיהוי של זוגות קינאז-מצע שימוש הקרנת תפוקה גבוהה
29 באוגוסט 2015
זרחון חלבונים הוא מאפיין מרכזי של האופן שבו תאים מפרשים ומגיבים למידע בסביבה החוץ-תאית שלהם. כאן, אנו מציגים פרוטוקול סינון בתפוקה גבוהה באמצעות קינאזות מטוהרות מתאי יונקים כדי לזהות במהירות קינאזות המזרחנות סובסטרט (ים) מעניין.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות קינאזות המזרחנים מצע מעניין באמצעות שיטות סינון בתפוקה גבוהה. זה מושג על ידי טרנסקטציה ראשונה של תאים עם פלסמידים המבטאים קינאזות FU לגלוטתיון כטרנספראז או GST. השלב השני הוא ביצוע משיכת קינאז GST.
לאחר מכן, הדגימות נטענות בג'לים, אשר לאחר מכן מופעלים ומוכתמים בצבע כחול מבריק קומאסי. השלב האחרון הוא ייבוש הג'לים וחשיפתם לסרט רדיוגרפיה אוטומטית. בסופו של דבר על ידי פיתוח ופירוש הסרטים המתקבלים, ניתן לזהות זוגות מצעי קינאז שכן כל נתיב מייצג בדיקת קינאז מובחנת.
השיטות הקיימות לזיהוי קינאז עבור מצע זרחני ידוע כוללות שימוש בגישות ביואינפורמטיות לחיפוש אתר קונצנזוס במצע, איתור קומפלקסים בין קינאז למצעים באמצעות טכניקות ביוכימיות וגישת ניסוי וטעייה, חיפוש מצעי קונצנזוס קונצנזוס על בסיס תפקידם הביולוגי הידוע. גישות אלו גוזלות זמן ולא תמיד זוכות להצלחה. הגישה שלנו מאפשרת זיהוי מהיר של זוגות סובסטרט קינאז על בסיס תוצאות פונקציונליות.
כשעלה בדעתנו לראשונה הרעיון לשיטה זו, חששנו שלא תהיה מספיק ספציפיות במבחנה. כפי שמתברר, הספציפיות של המצע מצוינת ולעתים קרובות אנו מגלים שרק קינאזות של בני משפחה מסוגלים לזרחן מצע נתון במסך. זה בולט במיוחד כאשר אנו מבצעים ריבוי באמצעות מספר מצעים בכל מסך, מה שמדגים את ההליך תהיה קורטני, טכנאית מהמעבדה שלי להתחיל את ההליך בהכנת ריאגנטים, צלחות ותאים כמתואר בפרוטוקול הטקסט.
אם הוקפאו צלחות המכילות פלסמידים של קינאז, יש להפשיר בטמפרטורת החדר ולצנטריפוגה ב-1900 פעמים G למשך שלוש דקות כדי לאסוף לחות בתחתית הבארות. מערבבים 8.6 מיליליטר של מדיום סרום מופחת עם 312.7 מיקרוליטר של מגיב טרנספקציה על בסיס שומנים, ומניחים לתערובת לשבת במשך חמש דקות לכל באר. מתוך צלחת 96 בארות המכילה את הפלסמידים של קינאז ב-10 מיקרוליטר של מדיום הסרום המופחת.
השתמש במתקן נוזלים אוטומטי המצויד בקלטת בנפח קטן, ולאחר מכן הוסף 10 מיקרוליטר מתערובת ריאגנטים בינונית מופחתת בסרום לכל באר, באמצעות מתקן נוזלים אוטומטי המצויד בקלטת בנפח קטן ואפשר לצלחת לשבת במשך 20 עד 45 דקות. לאחר מכן, החייאה משהה 2 93 תאי T ב-0.75 מיליון תאים למיליליטר ב-80 מיליליטר של דלקוס שלם ששונה שווה למדיום או DMEM ב-100 מיקרוליטר של תרחיף התאים לבאר. באמצעות מתקן נוזלים אוטומטי המצויד בקלטת נפח סטנדרטית, בדוק את הבארות תחת מיקרוסקופ עבור פיזור תאים אחיד לפני החזרת הצלחת לחממה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
כדי להתחיל את ניסוי ה-GST קינאז משוך כלפי מטה. הכינו תמיסת 4 מילי-מולרית לכל ונדאט על ידי ערבוב של 60 מיקרוליטר של 0.2 נתרן ונדאט מולרי עם 540 מיקרוליטר מים בשפופרת שנייה מעורבבת 2.7 מיקרוליטר של 30% מי חמצן ו-1.4 מיליליטר של מי מלח חוצץ פוספט או PBS. הוסיפו את שתי התמיסות יחד והשאירו את התערובת למשך 15 דקות לפני השימוש.
בעזרת פיפטה רב-ערוצית, מחלקים שני מיקרוליטר של 0.25 סידן כלורי מולארי בכל באר, ואחריהם 2.5 מיקרוליטר מתמיסת התמר המוכחת. דגרו כל צלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ולאחר מכן הניחו על קרח, תוך שמירה על הצלחות על קרח. הסר את המדיום מכל באר, באמצעות ואקום מיד ב-50 מיקרוליטר לבאר של מאגר ליזה קר כקרח.
בעזרת מתקן נוזלים אוטומטי המצויד בקסטה הסטנדרטית, הניחו לצלחת לשבת במשך 30 דקות על קרח לכינים. לאחר סיבוב הלוחות ב-1900 פעמים G למשך שלוש דקות בארבע מעלות צלזיוס, מגרדים את התאים מכל באר באמצעות פיפטה רב-ערוצית ומעבירים את כל התוכן ל-vbo המסומן כראוי. צלחות 96 באר מסובבות את הצלחות ב-1900 פעמים G למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס במהלך הסיבוב ממלאות צלחות מצופות גלוטתיון עם 100 מיקרוליטר לבאר של מאגר ליזה קר כקרח.
כשטיפה, שמור את הצלחות על קרח. לאחר צנטריפוגה של הלוחות התחתונים, הפוך את לוחות הגלוטתיון מעל כיור כדי לנער את מאגר הליזיס ולכתם על מגבת נייר. העבירו את מאגר הליזיס מהלוחות התחתונים V ללוחות הגלוטתיון על ידי הטיית הצלחת ושימוש בפיפטה רב-ערוצית, תוך הקפדה לא להפריע לגלולה בתחתית.
לאחר מכן מכסים את הצלחות ומשאירים על קרח למשך שעתיים לפחות. כדי לקשור קרוב לסוף שלב הכריכה בן השעתיים, הכן תחנת עבודה רדיואקטיבית המבטיחה את אמצעי הבטיחות הדרושים לעבודה רדיואקטיבית. מכוונים את תנור ההכלאה ל -30 מעלות צלזיוס.
הפוך את צלחות הגלוטתיון מעל כיור כדי לנער את מאגר הליזיס ולכתם על מגבת נייר. שטפו את הבארות שלוש פעמים עם 100 מיקרוליטר של מאגר ליזה ללא PMSF. אל תתנו לבארות לשבת יבשות.
שמור אותם בשטיפה עד שהם מוכנים להמשיך. לאחר מכן, הכן 55 מיליליטר של מאגר X קינאז אחד או x kb אחד כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הוסף 50 מיקרוליטר של 1 x kb לכל באר של הצלחת באמצעות מתקן נוזלים אוטומטי המצויד בקלטת נפח סטנדרטית.
לאחר מכן הכינו את פתרון A על ידי הכנת תמיסה המכילה את המצע המעניין ואת החלבון הבסיסי של המיאלין או MVP כמפורט בפרוטוקול הטקסט אחד בכל פעם. הפוך את הצלחות מעל כיור כדי להסיר את חלקת השטיפה האחת של XKB על מגבת נייר והוסף מיד 30 מיקרוליטר של תמיסה א. באמצעות מתקן נוזלים אוטומטי המצויד בקלטת בנפח קטן. שמור את הצלחות על קרח.
לאחר מכן, הכינו את תמיסה B באזור העבודה הרדיואקטיבי כמתואר בפרוטוקול הטקסט ב-20 מיקרוליטר של תמיסה B לבאר. בעזרת פיפטה משחזרת, המסייעת בערבוב עקב כוח פליטה מכסים ודוגרים את הצלחת בתנור הכלאה של 30 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר 30 דקות, העבירו את הצלחות בחזרה לקרח.
לאחר מכן הוסף 50 מיקרוליטר של שני x נתרן אקל סולפט או מאגר ליזה SDS לכל באר באמצעות פיפטה רב-ערוצית. כל העבודות בסעיף זה צריכות להתבצע באזור המיועד לפעילות רדיו. הפעל את תנור ההכלאה והגדר אותו ל 85 מעלות צלזיוס.
לאחר שהתנור הגיע לטמפרטורה, העבירו את הצלחות לתנור ודגרו למשך 10 דקות כדי לפרק את הדגימות. הטעינה הבאה. 26 ג'לים טרומיים היטב עם 15 מיקרוליטר מכל תגובה.
באמצעות פיפטה רב-ערוצית למילוי מספר בארות בבת אחת, יש להקפיד שכל הטיפים יתיישרו עם הבארות המתאימות. לפני הוספת הדגימות, הפעל את הג'ל ב -150 וולט. אל תתנו לקו הכחול לברוח מתחתית הג'ל מכיוון שהוא מכיל את ה-A TP הלא משולב. לאחר מכן פרק את הג'לים והסר את ה-TP הלא משולב מכיוון שהוא יכהה את חשיפת הג'ל על הסרטים.
מניחים את הג'לים במיכלים מסומנים ומכסים בכתם קומאסי למשך 15 דקות. לאחר מכן, הסר את כתם הקומאסי. שוטפים בקצרה את הג'לים במים ומוסיפים תמיסת עיכוב.
עצרו את הג'לים עד שהחלבונים נראים בבירור. רצועה ל-MVP ורצועה למצע צריכה להיות גלויה עבור כל דגימה. לייבוש הג'לים, חותכים דף גדול של נייר פילטר ומניחים אותו על המייבש.
הרטיבו דף צלופן במים מזוקקים עד שהוא חלק וללא קמטים והניחו אותו על גבי הנייר. הניחו את הג'לים על גבי דף הצלופן ורשמו את סדר הג'לים. הרטיבו דף צלופן שני והניחו על גבי הג'לים.
מרדדים את כל הבועות למשטח אחיד ויפה. סוגרים את הדש, מפעילים את הוואקום ומניעים את הג'לים במשך שלוש שעות בחום של 80 מעלות צלזיוס. לאחר שהג'לים יבשים, חשוף אותם לסרט רדיוגרפיה אוטומטי של תחליב כפול באמצעות מסך כדי להעצים את האות.
עוטפים את הקסטה בניילון או בשקית ניילון וסוגרים בנייר דבק כדי למנוע כפור לפני אחסון הקסטה במינוס 80 מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת, הוציאו את הקסטה מהמקפיא ותנו לה להפשיר בטמפרטורת החדר. פתח את הסרט בחדר חשוך באמצעות מעבד סרטים בהתאם להוראות היצרן המוצגות.
להלן תוצאות מייצגות ממסך 180 קינאזות הוקרנו באמצעות מצע פפטיד מתויג GST המתאים לחומצות אמינו 268 עד 283 מקו-אקטיבטור שעתוק מווסת kreb 2 או C RTC 2, כמו גם החלבון הבסיסי של מיאלין סובסטרט בדיקת קינאז קלאסי או MBP רק שניים. קינאזות סימן שתיים והקינאז הקשור מאוד, סימן שלוש זרחני. ה-MBP של CRTC שני פפטידים נכלל כבקרה פנימית בכל הבדיקות מכיוון שהוא מכיל שאריות זרחניות רבות הניתנות לחיבור ופועל ב-18 קילו-דלטון לכיוון תחתית הג'ל.
זה מאפשר פרשנות של ספציפיות. קינאזות מסוימות יזרחו חזק מצע ו-MVP. יש לציין כאן שהבארות המכילות GST לבדן תמיד מטהרות פעילות קינאז אנדוגנית כלשהי.
לפיכך, תמיד יש זרחון רקע בבדיקה. אמנם זה לא שולל שהזרחון של המצע הוא אמיתי, אבל זה כן מצביע על כך שבסביבה במבחנה, הקינאז עשוי להיות פחות סלקטיבי. זה אינפורמטיבי במיוחד לכלול מספר מצעים בעלי משקלים מולקולריים שונים כדי להסיק מסקנות לגבי ספציפיות מצע קינאז.
מכיוון שהמסך הוא במבחנה ורמות נוספות של מורכבות מתרחשות in vivo, יש לאמת קינאז מועמד בתאים. לדוגמה, קינאז מועמד עשוי להיות בעל יכולת לזרחן מצע במבחנה, הוא לא יתבטא באותו סוג תא או באותם תאי משנה של תא כמו המצע. זה נעשה בדרך כלל באמצעות השתקה בתיווך RNAi של המועמד.
אפשר גם לבצע סקר משני באמצעות מוטציה שאינה ניתנת לזרחן של המצע כדי לאשר את הספציפיות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול לסריקה בשפיעות גבוהה שנועד לזהות קינזים המבצעים פוספורילציה של סובסטרטים ספציפיים. השיטה משתמשת בקינזים שפו purified מתאי יונקים, מה שמאפשר ניתוח מהיר של פעילות הקינז.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- שליחויות תאיות
- פוספורילציה של חלבונים
- סריקה בתושבה גבוהה
רקע
- פוספורילציה של חלבונים היא קריטית לתגובות תאיות לאותים חיצוניים.
- זיהוי אינטראקציות בין קינאז לסובסטרט הוא חשוב להבנת מסלולי איתות.
- שיטות בעלות תפוקה גבוהה יכולות להאיץ את גילוין של אינטראקציות אלו.
- מחקר זה מתמקד בגישה סיסטמטית לסריקת קינזות פעילות.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול לזיהוי קינאזים המפספרים סובסטרטים ספציפיים.
- שימוש בסריקה בthroughput גבוה (high throughput screening) לצורך ניתוח מהיר.
- העמקת ההבנה של פעילות קינאזים בתהליכים תאיים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- טרנספקציה של תאים בפלסמידים המבטאים קינאזות המחוברות ל-glutathione S-transferase (GST).
- ביצוע GST kinase pulldown לבידוד קומפלקסים של קינאזה-סובסטרט.
- טעינת דגימות לתוך ג'לים לאלקטרופורזה.
- צביעת הג'לים בצבע Coomassie Brilliant Blue וניתוח באמצעות אוטורדיוגרפיה.
תוצאות עיקריות
- זיהוי מוצלח של זוגות קינאז-סובסטרט באמצעות הפרוטוקול שפותח.
- הדגמה של היעילות של שיטות סריקה בקיבולת גבוהה (high throughput screening).
- ויזואליזציה של פעילות קינאז באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל.
- פרשנות של סרטי אוטורדיוגרפיה לקביעת אינטראקציות ספציפיות.
מסקנות
- הפרוטוקול מזהה ביעילות קינאזות המפספסרות סובסטראטים רלוונטיים.
- סריקה בשפיות גבוהה היא כלי בעל ערך לחקר פעילות קינאזים.
- ניתן ליישם שיטה זו על סובסטראטים שונים כדי לחקור תפקודי קינאזים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
זיהוי בסבירות גבוהה של זוגות קינאז-סובסטרט הוא קריטי לפירוק רשתות אותים תאיות וקידום תיקוף מטרות בשלבים מוקדמים של גילוי תרופות. פלטפורמה זו מאפשרת מיפוי תפקודי מהיר של פעילות קינאז, ובכך תומכת בהסרת סיכונים מכניסטיים ובתעדוף של מסלולי אותים הרלוונטיים לביולוגיה של המחלה. גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי בנקודת המפנה של הגילוי, ומספקת מידע לקבלת החלטות לגבי תיקי פיתוח ופיתוח בדיקות המשך.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה תפקודית ישירה של קשרי קינאז-סובסטרט להבהרת מסלולים ביולוגיים.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי הבחנה בין פעילויות ספציפיות של קינאזים בתוך משפחות אנזימים גדולות.
- מקל על מיון מהיר של מטרות פוטנציאליות בהתבסס על ספציפיות לסובסטרט ורלוונטיות לאותות תאיים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מכין מערכות קינאז-סובסטרט מתוקפות עבור תהליכי סריקה ואפיון תרכובות בהמשך הדרך.
- מספק תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור באמצעות אוטורדיוגרפיה וקריאות המבוססות על ג'ל.
- מאפשר סריקה רב-ערוצית (multiplexed) וניתנת להרחבה של ספריות קינאזים מול סובסטרטים מגוונים.
- תומך בסטנדרטיזציה חסונה של הבדיקה לצורך הערכה אמינה של תרכובות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה את מיפוי הקינאז-סובסטרט למסלולי שילוח הרלוונטיים למחלה לצורך רציפות תרגומית.
- מספקת ראיות מכניסטיות להכוונת בחירת מודלים פרה-קליניים ואסטרטגיות של ביומרקרים.
- מפחיתה את הסיכון לכישלון ביולוגי בשלבים מאוחרים על ידי אישור מעורבות המסלול בשלב מוקדם.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
שיטת סריקה בעלת תפוקה גבוהה זו משתלבת בממשק שבין שלב הגילוי המוקדם לזיהוי מובילים (lead identification), ומגשרת בין תיקוף המטרה לפיתוח בדיקות ומחקר תרגומי.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות ובמיפוי מסלולים על ידי קישור ישיר של קינזים לסובסטראטים שלהם.
- סריקה: מספקת זוגות קינז-סובסטרט הניתנים לשחזור ומוכנים לבדיקה עבור פלטפורמות לסריקת תרכובות.
- אנליטיקה: מספקת תוצרי Autoradiography וכמותיים מבוססי ג'ל לצורך ניתוח השוואתי של פעילות קינז.
- מחקר תרגומי: מקשרת ספציפיות של קינז in vitro להקשרים תאיים הרלוונטיים למחלה לצורך התאמה של סמני ביולוגיים (biomarkers).
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמת סריקה לשימוש חוזר, הניתנת להתאמה לסובסטראטים ולספריות קינזים חדשות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של זיהוי קינאז-סובסטרט באמצעות תהליכי עבודה הניתנים לשכפול ולהרחבה.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת לגבי המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go) וקידום תיק פרויקטים ביעילות הונית.
- השפעה על תיק הפרויקטים: תומך בתעדוף מותאם סיכונים ומפחית נשירה ביולוגית בשלבים מאוחרים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בביולוגיה של קינאזים, טיהור חלבונים וטיפול בחומרים רדיואקטיביים.
- מחייב גישה לתשתיות של טיפול אוטומטי בנוזלים, אלקטרופורזה של ג'לים ואוטורדיוגרפיה.
- מצריך סטנדרטיזציה של תנאי הבדיקה והביקרים בין צוותים שונים להבטחת הדירות (reproducibility).
- התאמה לסובסטראטים או למשפחות קינאזים שונות עשויה לדרוש אופטימיזציה של הפרוטוקול.
- יש לפרש פוספורילציה ברקע וספציפיות in vitro בשילוב עם אסטרטגיות תיקוף in vivo.
