שיטה אופטימלית עבור בידוד והרחבת תאי Invariant הטבעי רוצח T מטחול העכבר
29 באוקטובר 2015
כאן אנו מציגים פרוטוקול מותאם שניתן להשתמש בו כדי ליצור מספר רב של תאי T רוצחים טבעיים קבועים של עכברים מטחול עכבר. הפרוטוקול מתאר גישה שבאמצעותה ניתן להעשיר תאי iNKT טחול, לבודד ולהרחיב אותם במבחנה באמצעות מספר מוגבל של בעלי חיים וריאגנטים.
המטרה הכוללת של הליך זה היא להרחיב במגוון תאי T או INKT קטלניים טבעיים שנקטפו מהטחול של העכבר. זה מושג תחילה על ידי בידוד תאים חד-גרעיניים של הטחול, ולאחר מכן העשרה של אוכלוסיית הלימפוציטים החיוביים CD 5 על ידי הפרדת תאים מגנטיים. לאחר מכן, חלק תאי ה-INKT הטחול מבודד עוד יותר על ידי מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות.
בשלב האחרון, תאי ה-INKT הממוינים יושבים להרחבה במבחנה. בסופו של דבר, פרופיל הציטוקינים של תאי ה-INKT המורחבים יכול להיות מוערך על ידי אלייזה. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שהטיהור וההרחבה של תאי INKT דורשים שילוב של טכניקות שונות לביצוע.
הליך זה יילקח על ידי סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי. לאחר קצירת הטחול, העבירו את הרקמה למסנן ניילון של 70 מיקרון, ולאחר מכן השתמשו בבוכנת מזרק של שני מיליליטר כדי למעוך בעדינות את הטחול דרך המסננת לצינור חרוטי של 50 מיליליטר ולשטוף את המסנן עם חמישה מיליליטר PBS. לאחר מכן הוסף שלושה מיליליטר מחבילת הפחם לצינור של 15 מיליליטר וכסה את שיפוע הצפיפות עם חמשת המיליליטר של המתלה הסלולרי.
הפרד את התאים באמצעות צנטריפוגה והעביר את הממשק לצינור חדש של 15 מיליליטר. לאחר מכן שטפו את התאים ב-10 מיליליטר PBS קר והשעו מחדש את הגלולה בשני מיליליטר של מאגר פקס כדי להעשיר עבור ה-CD חמישה לימפוציטים חיוביים של הטחול. התאם את דילול התאים לאחד פי 10 לתאים השביעיים לכל 90 מיקרוליטר עם יותר מאגר פקס והוסף 10 מיקרוליטר של מיקרו-חרוזים נגד CD חמישה לתאים.
לאחר 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס, שטפו את התאים עם ארבעה מיליליטר של מאגר פקס והשהו מחדש את הגלולה ב-500 מיקרוליטר של מאגר פקס טרי. בודד את ה-CD חמישה תאים חיוביים על ידי הפרדת תאים מגנטיים בהתאם להמלצת היצרן. לאחר מכן יש לדלל את ה-CD המועשר בחמישה לימפוציטים חיוביים בפעם אחת 10 לששת התאים לכל 20 מיקרוליטר אינקס מאגר המכיל אנטי CD 16, CD 32 ו-PE מצומד אלפא גלס אוויר CD 1D טטרמר בטמפרטורת החדר בחושך לאחר 30 דקות, לדגור על התאים עם הנוגדנים המעניינים בארבע מעלות צלזיוס בחושך למשך 30 דקות נוספות.
לאחר מכן שטפו את התאים במאגר פקס טרי וצבעו אותם ב-10 מיקרוליטר של תמיסת עבודה של 20 מיקרו-מולרית של DPI לכל אחד כפול 10 לששת התאים למשך חמש דקות. בטמפרטורת החדר רוכשים כעת בערך 1 פעמים 10 ל-CD המועשר הרביעי חמישה אירועי לימפוציטים חיוביים על ציטומטר הזרימה באופן אלקטרוני על הפיזור הקדמי עם תאים נמוכים כדי לא לכלול את הכפילות והאגרגטים של התאים באופן אלקטרוני. הוצא את ה-CD החיובי של DAPI שמונה תאים חיוביים ל-CD 19 בתוך הפיזור הקדמי עם אוכלוסייה נמוכה והשתמש בתרשים פיזור צדדי ואזור פיזור קדימה.
כדי לבחור אלקטרונית את הלימפוציטים, יש לשרטט את טטרמרים אלפא גל SER CD 1D על ידי CD שלושה אפסילון ובאופן אלקטרוני את אלפא גל סר CD 1D טטרמר חיובי CD שלושה תאי INKT חיוביים אפסילון כפי שמצוין. לאחר מכן, רכישת לא יותר מפעמיים 10 ל-CD החמישי, חמישה לימפוציטים מועשרים חיוביים קובעים את אחוז תאי ה-INKT החיוביים של אלפא גל SER, CD 1D, שלושה תאי INKT חיוביים של אפסילון הקיימים במקטע התאי המועשר. באמצעות מיון שער נמוך זה, האלפא אלסר CD 1D טטרמר חיובי CD שלושה תאי INKT חיוביים של אפסילון לתוך שפופרת פקס המכילה מיליליטר אחד של סרום עגל עוברי בסוף המיון.
שטפו את תאי ה-NKT המבודדים מהצד של צינור הפקס עם 10 מיליליטר של מדיום RPMI 1640. לאחר מכן סובב את התאים, השהה מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של RPMI 1640 והשתמש בכמות של 40 מיקרוליטר של התאים כדי להעריך את טוהר התאים הממוינים. שימוש באותה אסטרטגיית שער.
באשר להגדרת פרמטרי המיון להרחבת תאי ה-INKT, סובב את התאים והשהה מחדש את התאים המבודדים בחמש פעמים 10 עד לתאים החמישיים למיליליטר במדיום RPMI 1640 שלם בתוספת IL שניים, IL 12 ואנטי CD 28. לאחר מכן זרעו את התאים בפעם אחת 10 עד תאי ה-INKT החמישיים לבאר בצלחת מצופה אנטי CD עם תחתית שטוחה של 96 ודגרו אותם ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור תרבית תאים. לאחר יומיים, העבירו את התאים לצלחת באר תחתונה שטוחה טרייה לא מצופה 96 לתרבית בתנאי מנוחה ב-RPMI 1640 מלא.
בינוני לדגירה נוספת של יומיים. ביום הרביעי לאחר המיון, יש לזרוק בעדינות את הסופרנטנט בכל באר כדי לעקור את התאים ולאגד אותם בצינור חרוטי של 15 מיליליטר. לאחר צנטריפוגה, השעו מחדש את החך בחמש פעמים 10 עד החמישי תאים למיליליטר.
במדיום RPMI 16 מלא בתוספת IL שבע וזרע אחד כפול 10 עד חמישי תאים לבאר. בצלחת חדשה עם תחתית שטוחה של 96 בארות החזר את התאים לחממה לאחר ארבעה ימים, משוך אותם בצינור חרוטי טרי של 15 מיליליטר לצנטריפוגה. יש להשעות מחדש את הגלולה במדיום RPMI 1640 שלם המכיל אנטי CD 28 מסיס ולזרוע את התאים על צלחת תחתונה שטוחה של 96 באר המצופה באנטי CD שלושה אפסילון בפעם אחת 10 מהתאים החמישיים לבאר ולהחזיר את התאים לאינקובטור למשך שלושה ימים נוספים, ארבעה ימים, 11 עד 18.
חזור על הטיפול ב-IL 7 anti CD 28 ו-anti CD three epsilon כפי שהודגם זה עתה ביום ה-19. העבירו את התאים לצינור חרוטי חדש של 15 מיליליטר. סובב אותם והשהה מחדש את הגלולה בחמש פעמים 10 עד חמישית תאים למיליליטר ב-RPMI 1640 שלם.
לאחר מכן זרעו את התאים בפעם אחת 10 עד חמישית תאים לבאר בצלחת תחתונה שטוחה של 96 בארות ואפשרו לתאים לנוח במשך יומיים בחממת תרבית התאים. גירוי תאי INKT ממוינים עם אנטי CD שלוש אפסילון כרוך בצלחת בנוכחות IL 2 IL 12 ואנטי CD 28 מסיס מביא להרחבה של בערך פי שלושה של מספרי INKT לאחר יומיים של תרבית. התרחבות עוקבת של תאי ה-INKT בנוכחות IL 7 מביאה לעלייה של פי שלושה עד ארבעה במספר תאי ה-INKT הקיימים ביום הרביעי בתרבית.
יש לציין שחזרה על תנאי תרבית אלה יכולה להניב בממוצע שבע פעמים 10 לתאי ה-INKT השביעיים לאחר שני סבבי התפשטות ללא אובדן נראה לעין של תאים בין השינויים במצע התרבית בימים שונים, וכתוצאה מכך התרחבות של לפחות פי 70 ב-18 ימים. תאי INKT מורחבים נוספים המופעלים עם מורין רקומביננטי קשור לצלחת. CD 1D עמוס באלסר אלפא מייצר IL 2 IL 4 IFN gamma, TNF alpha ו-IL 6 ב-48 שעות לאחר הגירוי, מה שמדגים שתאי ה-INKT שומרים על יכולתם לייצר ציטוקינים TH אחד ו-TH שני לאחר התפשטות.
בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור כי צביעה נכונה של תאי INKT עם cdre טעון אלפא סרמיד חיונית לזיהוי תאי ה-INKT בזמן זרימה ציטומטרית. בטוח.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר שיטה להרחבה של תאי T הורגים טבעיים בלתי משתנים (iNKT) מטחול של עכבר. הוא מפרט את הבידוד וההעשרה של תאי iNKT ספלניים לצורך הרחבה in vitro, תוך שימוש במספר מוגבל של בעלי חיים וריאגנטים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- אימונולוגיה
- ביולוגיה של התא
- פרוטוקולים ניסיוניים
רקע
- תאי T killer טבעיים אינווריאנטים (iNKT) ממלאים תפקיד מכריע בתגובות חיסוניות.
- בידוד והרחבה של תאי iNKT חיוניים ליישומים מחקריים שונים.
- שיטות מסורתיות עשויות להיות עתירות משאבים ומורכבות.
- פרוטוקול זה נועד לייעל את התהליך כדי להנגיש אותו בצורה טובה יותר.
מטרת המחקר
- מתן שיטה מהימנה להרחבה של תאי iNKT מטחול עכבר.
- שיפור התניב של תאי iNKT תוך שימוש במשאבים מינימליים.
- סיוע למחקרים עתידיים על התכונות הפונקציונליות של תאי iNKT.
שיטות שנערכו
- בידוד תאים מונונוקליאריים מהטחול.
- העשרה של לימפוציטים חיוביים ל-CD5 באמצעות הפרדת תאים מגנטית.
- בידוד תאי iNKT מהטחול באמצעות מיון תאים מופעל פלואורסצנציה (FACS).
- הרחבה של תאי iNKT ממוינים במבחנה (in vitro).
תוצאות עיקריות
- בידוד והרחבה מוצלחים של תאי iNKT מטחול של עכבר.
- הדגמה של פרופיל הציטוקינים של תאי iNKT שהורחבו.
- זיהוי אתגרים העומדים בפני חוקרים המתנסים בשיטה לראשונה.
- אספקת פרוטוקול יעיל ומפושט למחקרים עתידיים.
מסקנות
- הפרוטוקול המותאם מגדיל ביעילות את התנובה של תאי iNKT.
- הוא מפשט את התהליך והופך אותו לנגיש יותר עבור חוקרים.
- מחקרים עתידיים יכולים להשתמש בתאי iNKT מורחבים עבור יישומים שונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בידוד והרחבה יעילים של תאי T killer טבעיים אינווריאנטים (iNKT) מעכברים מאפשרים מידול פרה-קליני חסון של אינטראקציות חיסוניות מולדות-אדפטיביות. זרימת עבודה מותאמת זו תומכת ביצירה של תאי iNKT פונקציונליים בתשואה גבוהה עבור מחקרים מכניסטיים, תיקוף מטרות ומחקרים תרגומיים. השיטה מגבירה את הביטחון הניבויי בצינורות גילוי הממוקדים באימונולוגיה על ידי אספקת גישה סטנדרטית וניתנת להרחבה לאוכלוסיות תאים רלוונטיות למחלה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של מסלולים חיסוניים המתווכים על ידי תאי iNKT לצורך תיקוף המטרה.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי אספקת תאי iNKT מאופיינים תפקודית לבדיקת היפותזות.
- מסייע במיון הפורטפוליו על ידי הבהרת תפקידם של תאי iNKT במודולציה חיסונית.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מספק מקור הדיר תאוי iNKT עבור בדיקות in vitro סטנדרטיות.
- מאפשר הערכה כמותית של פרופילי הפרשת ציטוקינים לאחר ההרחבה.
- תומך ביכולת הרחבה של הבדיקה ובשימוש חוזר בפלטפורמה לסריקת תרכובות המכוונות לביולוגיה של תאוי iNKT.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתיישב עם מערכות מודל רלוונטיות למחלה על ידי אפשור מעבר in vivo של תאי iNKT מורחבים.
- שומר על ייצור תקין של ציטוקינים, ובכך תומך במחקרי סממנים ביולוגיים תרגומיים.
- מקל על הרציפות משלב הגילוי ועד לשלב התיקוף הפרה-קליני של חומרים מווסתי-חיסון.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
שיטה זו משתלבת ברצף הגילויים בתחום האימונולוגיה, החל מתיקוף מטרות מוקדם, דרך פיתוח בדיקות ועד למודלים פרה-קליניים.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים באמצעות תאי iNKT מטוהרים ופונקציונליים.
- סריקה: מספקת תאי iNKT מוכנים לבדיקה עם הרחבה ופלט ציטוקינים הניתנים לשחזור.
- אנליזה: מאפשרת מדידה כמותית של פרופילי ציטוקינים לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: מספקת תאים מורחבים להעברה in vivo והתאמה של סמנים ביולוגיים במודלים של מחלות.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת זרימת עבודה סטנדרטית וניתנת להרחבה לשימוש חוזר בתוכניות אימונולוגיה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרי מסלולים חיסוניים.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של הכנת תאי iNKT, המשפרת את השחזוריות ואת יכולת ההרחבה.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת לגבי המשך או הפסקה של מחקר (go/no-go) ומפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים בתיקי נושאי אימונולוגיה.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכון ובקידום של מועמדים למודולציה חיסונית.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בציטומטריה של זרימה, הפרדה מגנטית של תאים וטכניקות של תרביות תאים.
- נדרשת גישה למכשור FACS ולפלטפורמות לניתוח ציטוקינים (למשל, ELISA).
- נדרשת סטנדרטיזציה בין-צוותית של אסטרטגיות ה-gating והמיון לצורך הדירות (reproducibility).
- התאמה למערכות מודל אחרות עשויה לדרוש אופטימיזציה של הפרוטוקול עבור תנובת התאים והטוהר שלהם.
- צביעה ו-gating נכונים הם קריטיים לזיהוי מדויק של תאי iNKT ולשימוש בהם בשלבים הבאים.
