דוגמנות מוגבלת Capsular אוטם בעזרת טכניקת Photothrombotic
2 ביוני 2016
כתב יד זה מתאר טכניקת דוגמנות של אוטם קופסית. כאן השתמשנו בטכניקת photothrombotic שונה עם בעצימות נמוכות של אור לאחר מיפוי היעד מראש ניתוח. באמצעות טכניקה זו, יצרנו מודל אוטם קופסית מתוחם עם לקויות מוטוריות מתמיד.
המטרה הכוללת של טכניקה זו היא ליצור מודל אוטם קפסולה מוגבל עם ליקוי מוטורי מתמשך בטכניקה פוטוטרומבוטית. לפני יצירת אוטם הקפסולה, יש צורך לזהות את אזור הגפיים הקדמיות בקפסולה הפנימית על ידי החדרת וירוס הקשור לאדנו המבטא GFP לאזור הגפיים הקדמיות של קליפת המוח המוטורית. התחל בהנחת חולדה מורדמת לתוך מסגרת סטריאוטקסית.
לאחר מכן גלחו את ראש החולדה ועקרו את הקרקפת באמצעות 70% אלכוהול ותמיסת פובידון ויוד. יש להזריק 2% לידוקאין הידרו כלוריד מתחת לקרקפת באזור החתך המיועד בקרקפת כדי להפחית כאבים תוך ניתוחיים. יש למרוח משחה עיניים למניעת ייבוש העיניים.
והניחו וילון סטרילי מעל החיה. לאחר ביצוע חתך בקו האמצע של שני סנטימטרים בקרקפת, מקם את הזרוע הסטריאוטקסית כדי לזהות את אזור הגפה הקדמית של קליפת המוח המוטורית על פי הקואורדינטות הסטריאוטקסיות. קדחו חור כניסה במצב זה.
העבירו את המחט לחור הקדוח והורידו את המחט מילימטר אחד דרך הדורה ולתוך קליפת המוח המוטורית. השתמש במשאבת מיקרו דיוק גבוהה כדי להזריק לאט מיקרו ליטר אחד של נגיף. השאירו את המחט במקומה למשך 10 דקות נוספות כדי למנוע זרימה חוזרת במעלה דרכי המחט.
לאחר שחלפו 10 דקות, משוך לאט את המחט. לאחר ניקוי אתר הניתוח בהשקיה מלוחה, אבטח את הפצע בתפר ניילון 3-0. לאחר מכן שחררו את החולדה מהמסגרת הסטריאוטקסית והעבירו אותה לתא התאוששות לצורך מעקב.
מתן משכך כאבים לשליטה בכאב לאחר הניתוח. לאחר שבועיים-שלושה, הקריבו את החולדה על פי שיטות מאושרות וחתכו את המוח המוגן בהקפאה. לאחר צביעה עבור GFP, התבונן באקסונים המתמרים AAV-GFP בקפסולה הפנימית עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
השווה את מיקומי האקסונים המומרים כפי שניתן לראות בתמונה הפלואורסצנטית עם אטלס מוח החולדה כדי לקבוע במדויק את הקואורדינטות הסטריאוטקסיות של האקסונים המומרים. כדי להכין את הממשק העצבי האופטי, השתמש תחילה במקדחת חיתוך כדי לחתוך כארבעה סנטימטרים של מחט עמוד שדרה בגודל 27 עם סטילט בפנים. ואז הפשיט 10 סנטימטרים מהמעיל של סיב אופטי.
הכנס את החלק הלא מעטפת של הסיב האופטי לתוך צינור מתכת. ומהדקים את הצינור סביב הסיב. לאחר מכן השתמש בלחיצה כדי להדק את 1/2 התחתון של צינור המתכת פעמיים.
צינור המתכת ממלא את החלל שבין הסיב האופטי לרכזת מחט עמוד השדרה. מרחו אפוקסי הניתן לריפוי בחום על הסיב האופטי. מרחו אפוקסי נוסף על החלל הריק ברכזת.
והכנס את הסיב האופטי למחט עמוד השדרה. רפאו את האפוקסי למשך 20 דקות בחום של 100 מעלות צלזיוס לקיבוע יציב. לאחר הריפוי, חתכו את הסיב האופטי הבולט מתוך מחט עמוד השדרה ולאחר מכן השתמשו ביריעות חיפוי יהלום כדי ללטש את הסיב האופטי בקצה מחט עמוד השדרה.
לבסוף, חבר את חלק מחבר ה-FCPC של כבל התיקון למצמד של מערכת הלייזר הירוקה. לאחר מכן השתמש במד כוח ואנרגיה אופטי דיגיטלי כדי למדוד את עוצמת האור מקצה הסיב האופטי כדי להבטיח פליטה מדויקת של אור. הניחו כרית חום מתחת לגוף החיה כדי לשמור על טמפרטורת הגוף על 37.5 מעלות צלזיוס חשב הניתוח.
התחל בהרדמה והכנת החולדה לניתוח כמו קודם. לאחר ביצוע חתך בקו האמצע של שני סנטימטרים, כוונן את גובה מהדק האף עד שהברגמה והלמבדה מיושרים באותה רמה. היישור הנכון הוא קריטי כדי למקד נכון את הקפסולה הפנימית.
מקם את הזרוע הסטריאוטקסית כדי לאתר את האתר לפוטוטרומבוזה. ואז קדחו חור של שני מילימטר בשלב זה. לאחר מכן, יש ללטש ולנקות את קצה הסיב האופטי של ה-ONI, ואז לתקן אותו למסגרת הסטריאוטקסית מבלי להתכופף.
בדוק את קצה ה-ONI כדי לוודא שהוא נקי ושלם. מדוד את עוצמת הלייזר מקצה הסיב האופטי לפני הכנסת הממשק האופטי לאתר המטרה של מוח החולדה. כוונן את עוצמת הלייזר ל-3.5 מילי-וואט בקצה הסיב האופטי.
כעת, הורד את ה-ONI לאזור היעד של הקפסולה הפנימית באמצעות הקואורדינטות הדורסובנטרליות שנקבעו בחלק הראשון של הפרוטוקול. לאחר מכן, הזריק שני מיליגרם לק"ג רוז בנגל דרך וריד הזנב ולאחר מכן התחל טיימר ספירה לאחור המוגדר לדקה אחת. לאחר שחלפה הדקה, הפעל את הלייזר הירוק 532 ננומטר למשך 90 שניות כדי ליצור את הניתוק.
לאחר הקרנה, הסר בעדינות את ה-ONI מהמוח. לאחר ניקוי אתר הניתוח, אבטח את הפצע בתפר ניילון 3-0. לאחר מכן הסר את החולדה מהמסגרת הסטריאוטקסית והעביר אותה לתא התאוששות.
תמונה זו מציגה את היקף נגעי האוטם בעוצמות שונות של אור לייזר משני מילי-וואט לחמישה מילי-וואט שבועיים לאחר הנגע הפוטו-טרומבוטי. החצים מציינים את נגע האוטם. עוצמת האור האופטי נחשבת בין שלושה מילי-וואט לארבעה מילי-וואט בסביבה ניסיונית זו.
שתי התמונות הבאות מראות את המראה המיקרוסקופי של אוטם הקפסולה שלושה שבועות לאחר הפוטותרופוזיס. בחלק עטרה זה של מוח העכברוש, ראשי החצים מציינים את נתיב המחט המכיל את הסיב האופטי בתלמוס ועד לקפסולה הפנימית. קטעים מוכתמים סדרתיים אלה מראים את היקף נגע האוטם בקפסולה הפנימית.
החצים מציינים את נגע האוטם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
כתב יד זה מתאר טכניקה למידול אוטם קפסולרי באמצעות שיטה פוטותרומבוטית משופרת. גישה זו מאפשרת יצירת מודל של אוטם קפסולרי מוגדר הגובל באזור מסוים, אשר גורם לליקוי מוטורי מתמשך.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- נוירוביולוגיה
- ליקוי מוטורי
רקע
- אוטמים קפסולריים קשורים לליקויים מוטוריים.
- טכניקות פוטו-תרומבוטיות משמשות להשראת פגיעות מוחיות מוקלות.
- הבנת המנגנונים של ליקויים מוטוריים היא חיונית לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות.
- מיפוי המטרה חיוני ליצירה מדויקת של מודלים.
מטרת המחקר
- פיתוח מודל מהימן של אוטם קפסולרי.
- בחינת ההשפעות של אוטמים קפסולריים על התפקוד המוטורי.
- שימוש בטכניקה פוטו-תרומבוטית משופרת למיקוד מדויק.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- זיהוי אזור הגפה הקדמית בקפסולה הפנימית באמצעות וירוס אדנו-אסוסיאטיבי המבטא GFP.
- הכנת החולדה באמצעות הרדמה והצבה במסגרת סטריאוטקסית.
- סטריליזציה של קרקפת והכנה לחתך.
- הזרקת לידוקאין להפחתת כאב תוך-ניתוחי.
תוצאות עיקריות
- יצירה מוצלחת של מודל אוטם קפסולרי מוגדר.
- הדגמה של ליקוי מוטורי מתמשך לאחר האוטם.
- תיקוף של הטכניקה הפוטותרומבוטית המעודכנת.
- ביסוס של שיטה הניתנת לשחזור עבור מחקרים עתידיים.
מסקנות
- הטכניקה הפוטו-תרומבוטית המודגשת יעילה למידול אוטמים קפסולריים.
- ניתן להשתמש במודל זה כדי לחקור ליקויים מוטוריים והתערבויות פוטנציאליות.
- נדרש מחקר נוסף כדי לבחון את המנגנונים שבבסיס הגירעונות המוטוריים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
טכניקה פוטו-תרומבוטית זו מאפשרת מידול מדויק של שבץ בחומר הלבן על ידי התמקדות סלקטיבית ב capsula interna תוך השארת החומר האפור הסמוך ללא פגע. האוטם הקפסולרי המוגבל שנוצר גורם לגירעונות מוטוריים מתמשכים, ובכך מספק מערכת רלוונטית למחלה לצורך הפחתת סיכונים מכניסטיים של מועמדים לטיפול נוירותרפיתי. המודל תומך בתיקוף מטרות ובהערכה פרה-קלינית של התערבויות המכוונות לפתולוגיה של החומר הלבן, ובכך נותן מענה לפער קריטי במחקר השבץ.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות הקשורות לפתופיזיולוגיה של שבץ בחומר הלבן.
- ערך תפעולי: מספק מערכת רלוונטית למחלה לצורך תיקוף תפקודי של מטרות במעגלים מוטוריים.
- ערך ניבוי: תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי קישור מיקום האינפקט לליקוי מוטורי מתמשך.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- ערך מדעי: יוצר נפחי נגעים מדידים באמצעות תיתור עוצמה אופטית להערכת תגובה למינון.
- ערך תפעולי: מספק מודלים של אוטם (infarct) בעלי יכולת שחזור גבוהה עם תוצאות עקביות של ליקויים מוטוריים.
- מוכנות הבדיקה: מכין מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף לסריקת תרכובות בהמשך התהליך עבור נוירופרוטקציה או שיקום עצבי.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מדמה שבץ בחומר הלבן ברמות ההתנהגות, המעגל והתא לצורך תיקוף פרה-קליני.
- קידום מותאם סיכונים: מסייע בקבלת החלטות המשך (go/no-go) בהתבסס על ספציפיות הנגע והמתאם עם התוצאה התפקודית.
- סנכרון סממנים ביולוגיים: מאפשר ביסוס מתאם בין היקף האינפקט לחומרת הליקוי המוטורי לצורך פיתוח סממנים ביולוגיים ניבויים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מזיהוי המטרה ועד לבדיקת יעילות פרה-קלינית, ובכך מאפשרת שכלול איטרטיבי של אסטרטגיות לטיפול נוירו-תרפויטי.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות לגבי פגיעות של החומר הלבן ושיבוש של מסלולים מוטוריים ספציפיים למעגלים.
- סריקה: מאפשרת סטנדרטיזציה של בדיקה באמצעות בקרה מדויקת של הנגעים ודירוג כמותי של גירעון מוטורי.
- אנליטיקה: מספקת מדידות נפח של אוטם (infarct) ומדדים התנהגותיים לצורך ניתוח השוואתי של תנאים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין ממצאי הגילוי לרצף פרה-קליני באמצעות פנוטיפינג עקבי של גירעון מוטורי.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה לשימוש חוזר לצורך בדיקות איטרטיביות של תרכובות נוירופרוטקטיביות ושיקומיות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזוי במעורבות המטרה באמצעות מידול סלקטיבי של אוטם בחומר הלבן.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה ויכולת שחזור באמצעות כיול עוצמת הלייזר ומיקוד סטריאוטקסי.
- ערך אסטרטגי: הפחתת סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים על ידי מתן אפשרות להפחתת סיכונים מכניסטיים מוקדמת של מסלולי חומר לבן.
- השפעה על הפורטפוליו: תיעדוף של תרכובות מותאם סיכון בהתבסס על היכולת להפחית ליקויים מוטוריים מתמשכים במודל שעבר ולידציה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בהחדרת וקטורים ויראליים, בניתוחים סטריאוטקסיים ובייצור ממשקים עצביים אופטיים.
- תלוי במכשור מדויק הכולל מסגרות סטריאוטקסיות, מיקרו-מזרקים ומערכות לייזר מכויילות.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית להבטחת עקביות של הטיטר הוויראלי, הכנת סיבים אופטיים וניטור לאחר הניתוח.
- שיקולי התאמה כוללים קואורדינטות סטריאוטקסיות ספציפיות למין ותכונות אופטיות של חומר אפור לעומת חומר לבן.
- מגבלות מעשיות כוללות את המורכבות הניתוחית ואת הצורך בתיקוף לאחר הניתוח באמצעות היסטולוגיה והתנהגות.
שאלות נפוצות בתחום הביו-פארמה
Chapters in this video
0:05
Title
0:40
Identification of the Forelimb Area in the Internal Capsule Using AAV-GFP
3:09
Construction of the Optical Neural Interface
4:41
Photothrombotic Infarct of the Internal Capsule
6:44
Results: Microscopic Appearance of Capsular Infarct after Photothrombosis
7:38
Conclusion
