זיף-אותת התניה קלסית ומצמץ בעיניה עכברי ראש הקבועות
30 במרץ 2016
התכשיר המוצג כאן למיזוג מצמוץ עם סימן שפם בעכברים מקובעים בראש מגרה במדויק שפם ספציפי תוך מתן אפשרות לעכברים לנוע על הליכון גלילי. גירוי מותנה לגירוי שפם (CS) בשילוב עם גירוי לא מותנה של הלם פריאורביטלי (US) מביא ללמידה אסוציאטיבית אמינה על מכשיר זה.
המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא להשתמש בהתקדמות הגנטית בעכברים, ובהבנה שלנו את מערכת השפם, כדי לחקור את הבסיס הנוירוביולוגי של התניה במצמוץ, פרדיגמה ניתנת לתרגום לחקר למידה וזיכרון. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מכניסטיות בלמידה וזיכרון על ידי שימוש בהדמיית סידן ואלקטרופיזיולוגיה בעכברים שעברו מניפולציה גנטית תוך גירוי שפם ספציפי במהלך ההתנייה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא היכולת לאבטח את ראשי העכברים תוך מזעור מתח, על ידי מתן אפשרות לעכברים לנוע בקצב שלהם על הליכון גלילי.
ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפולים פוטנציאליים לליקויי זיכרון, כולל אלה הקשורים להזדקנות נורמלית ומחלת אלצהיימר. הכנת הצילינדר ומערכת גירוי השפם מכוסים כל אחד בפרוטוקול הטקסט. חלק זה מכסה את הכנת כיסוי הראש.
רצועת כיסוי הראש היא רצועת שבעה חורים מודפסת בתלת מימד המעוצבת מרצועת ניילון מסדרת Amphenol 221 שאינה מיוצרת עוד באופן מסחרי. מהיצירה המודפסת בתלת מימד, הקש על החור הראשון ברצועה עבור בורג מכונה בגודל 0-80 על אינץ' אחד והשאיר חור אחד ריק לאחר החור הראשון. לאחר מכן, בעזרת סגן, הניחו חמש סיכות מצופות זהב בחמשת החורים הנותרים.
דחוף את הסיכות דרך החורים הצרים יותר בפלסטיק. לאחר מכן, בעזרת חשפנית תרמית, הפשיטו חצי סנטימטר של ציפוי פולימיד. לאחר מכן, הלחמו את הקצה המופשט לאחד הפינים שבהם יש פתח לסיכה.
חותכים את החוט המולחם בין שישה לשבעה מילימטרים ומפשיטים כשני מילימטרים מהחוט. כעת, חזור על תהליך זה כדי לחבר ארבעה חוטים בסך הכל לחמשת הסיכות. שני החוטים הראשונים יתעדו תגובות EMG של העפעפיים ואילו השניים השניים יספקו גירוי חשמלי לאזור הפריאורביטלי.
לפין החמישי, הלחמו חוט נירוסטה לא מבודד של חמישה סנטימטרים שישמש כהארקה חשמלית. לאחר ביצוע כל החיבורים, בדוק כל אחד מהם באמצעות מולטימטר כדי להבטיח את המשכיותם החשמלית. התחל עם בעל חיים מורדם לחלוטין, שאושר על ידי צביטה בבוהן.
יש להזריק מנה של בופרנורפין הידרוכלוריד כמשכך כאבים. לאחר מכן מרחו כמות קטנה של משחת עיניים על הקרניות וגלחו את החלק העליון של ראש החיה. לאחר מכן, הצמידו את ראש החיה למסגרת סטריאוטקסית וחטאו את הקרקפת בשלושה קרצוף לסירוגין של פובידון, יוד ואלכוהול.
בעזרת להב אזמל מספר 10 או 15, בצע חתך לאורך קו האמצע של הקרקפת, וחשוף את הגולגולת מקדמת העיניים אל מעבר לעצם הבין-קודקודית. משוך את דשי העור עם שישה מיקרוקליפסים, וחשוף כמה שיותר מהגולגולת, כולל הצדדים והגב. לאחר מכן, השתמש באזמל כדי לגרד את הפריאוסט מהגולגולת.
לאחר מכן נקו את החלק העליון של הגולגולת עם מי חמצן 3% שלוש פעמים. לאחר שהגולגולת התייבשה, קדחו שני חורים עם בור חרוט הפוך בגודל 34, והקפידו לא לפגוע במוח. הניחו חור אחד מול הברגמה, והניחו את החור השני מול הלמבדה, משמאל לקו האמצע בעת התניה של עין ימין, או להיפך.
יש לקדוח חורים אלה בזהירות כך שיתאימו לברגים, ויש לעשות מאמץ רב כדי לא לפגוע במוח. לתוך החורים, הנח ברגים לחיבורי החשמל. כל סיבוב מלא יוריד את הבורג ב-0.28 מילימטרים, כך שמספיקים שני סיבובים מלאים.
לאחר מכן, צור מספר דיוויזות קטנות על הגולגולת על מנת להגדיל את שטח הפנים של המלט. מכיסוי הראש שהושלם, סובב את חוט ההארקה בתצורת שמונה סביב שני הברגים. השאירו מעט רפיון בחוט ההארקה כדי שניתן יהיה למקם את כיסוי הראש כראוי.
כעת, מרחו מלט לוטינג קר. מצפים את הגולגולת והברגים בנדיבות ומניחים למלט להתייבש. לאחר ייבוש המלט, מקם את כיסוי הראש בצורה אנכית, כשהפינים עומדים מעל הגולגולת.
אבטח את כיסוי הראש עם מחזיק המחובר לזרוע מהמסגרת. על המחזיק להיות בעל חמישה שקעים מצופים זהב כדי לקבל את סיכות כיסוי הראש. מקם את שני חוטי ה-EMG על ה-muscularis orbicularis oculi מעל ארובת העין.
לאחר מכן, מקם את שני החוטים המגרים. שים את הקצוות המופשטים מתחת לעור שניים עד ארבעה מילימטרים ישירות לעין. אל תתנו לקצותיהם לגעת זה בזה.
אם החוטים כל כך ארוכים שהם יכולים לשרוט את עין החיה, חתוך אותם לאחור או כופף אותם לאחור. חוט חשוף כלשהו חייב להישאר חשוף. כעת, מלטו את בסיס החוטים לגולגולת עם קצת יותר מלט לוטה והניחו לו להתייבש.
השתמש בכמחצית מאמצעי האחסון ששימש בעבר. כדי להמשיך, הסר את המיקרוקליפים ומקם מחדש את העור. אפשר לעור להתיישב באופן טבעי כדי למנוע מתח על העור שיעוות את העפעף, יעכב מצמוץ ובכך יהרוס את הניסוי.
לאחר שהעור התייצב, הסר את מחזיק כיסוי הראש ואטום את האזור החשוף במלט דנטלי. הימנע מטפטוף מלט על העיניים, או על סיכות כיסוי הראש. לאחר מכן השתמש במקלון צמר גפן טבול בממס צמנט דנטלי כדי להחליק ולתפעל מלט שנרפא חלקית לפי הצורך.
לאחר שהמלט התייבש לחלוטין, הסר את בעל החיים מהמסגרת הסטריאוטקסית ואפשר לו להתאושש על משטח חם לפני החזרתו לכלוב הביתי שלו. התחל להרגיל עכברים לאחר שהיו להם לפחות חמישה ימים של זמן התאוששות. כדי לאבטח את העכבר, רסנו אותו לזמן קצר בזנב כדי לצבוט אותו מאחורי הכתפיים.
לאחר מכן הרם את העכבר מתחת לבטן ולפלג גוף עליון. לאחר מכן, חבר מחבר לכיסוי הראש וסובב את בורג הנעילה. לאחר מכן, הנח את העכבר בעדינות על הצילינדר והחזק אותו ללא תנועה תוך שימוש בשני ברגים כדי להדק את המחבר לסורגים שמעל הצילינדר.
לאחר מכן שחרר את העכבר. בשני המפגשים הראשונים, תנו לעכבר להתרגל לצילינדר למשך אותו פרק זמן כמו מפגש התניה. במהלך ההתרגלות, רשום את קצב המצמוץ הספונטני.
כמו כן, חשפו מראש את העכברים לממריץ הרטט של השפם מבלי להפעיל גירוי חשמלי. כשמערכת הפיזו קרובה לצד הממוזג, החלק את שיני המסרק על שפם בודד. בחר את אותם שפמים לכל מפגש.
לאחר מכן המשך באימון התניה קלאסי כפי שמוצג בטקסט. עכברי C57 Black 6J זכרים בני שמונה עד עשרה שבועות אומנו עם התניה של עקבות מצמוץ בהליכון הגלילי המקובע בראש. הקלטות EMG של כל ניסוי נלקחו.
ה-EMG תוקנו ושולבו עם קבוע זמן של 10 אלפיות השנייה, ולאחר מכן נמדדו בממוצע על פני כל הניסויים. האבולוציה של תגובות מותנות במשך 10 אימונים מראה כי בהדרגה התגובה גדלה במשרעת והשהיית התגובה התקצרה. התפתחות זו אינה נראית בתגובות של העכברים הפסאודו-מותנים, שבהם הגירויים מוצגים בסדר אקראי.
ניתן לראות את האבולוציה של תגובות מותנות מתוזמנות היטב, ולכן נלמדות היטב, גם בהיסטוגרמות של הזמן עד לשיא התגובה לאחר הופעת ניתוח קיסרית. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין את כיסוי הראש, להשתיל בניתוח את כיסוי הראש על עכבר, ולהניח את העכבר על ההליכון הגלילי, למיזוג מצמוץ ראשי. העכברים שלך צריכים להפגין עקומת למידה טובה לאורך ימים כשהם רוכשים את ההתנייה.
לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שעה אחת אם היא מבוצעת כראוי. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להישאר ערניים בהתבוננות בכל מצוקה של בעלי החיים. יש לנקוט בצעדים מתאימים על מנת למזער את הלחץ על בעלי החיים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מפרט שיטה להתרגלות של עגמגי עיניים המופעלת על ידי שפם בעכברים מקובעי ראש, המאפשרת גירוי מדויק של השפם תוך מתן אפשרות לתנועה על מסוע גלילי. גישה זו מקלה על חקירת הבסיס הנוירוביולוגי של למידה וזיכרון באמצעות פרדיגמות של למידה אסוציאטיבית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- התניה התנהגותית
- למידה וזיכרון
רקע
- התניית מצמוץ עיניים היא מודל לחקר למידה אסוציאטיבית.
- גירוי של שפם משמש כגירוי מותנה בפרדיגמה זו.
- קיבוע הראש ממזער את הלחץ תוךما מתן אפשרות לתנועה.
- ניתן להשתמש בדימוי סידן ובאלקטרופיזיולוגיה כדי להשיג תובנות מעמיקות יותר.
מטרת המחקר
- לבחון את המנגנונים הנוירוביולוגיים העומדים בבסיס התניית מצמוץ העין.
- לנצל התקדמויות גנטיות בעכברים לשיפור תוצאי הניסוי.
- לחקור טיפולים פוטנציאליים לליקויי זיכרון.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנה של מכשיר ה ट्रेडמיל הגלילי.
- יישום של גרייה של השפנים במהלך ההתניה.
- שימוש בעכברים שעברו מניפולציה גנטית למחקרים ממוקדים.
- יישום של טכניקות דימות סידן ואלקטרופיזיולוגיה.
תוצאות עיקריות
- למידה אסוציאטיבית אמינה הושגה באמצעות השיטה המתוארת.
- הטכניקה מאפשרת לחקור מנגנוני למידה וזיכרון.
- קיבוע ראש בשילוב עם הליכה על מסוע מפחית את רמת הלחץ בקרב הנבדקים.
- צוינו השלכות פוטנציאליות להבנת ליקויי זיכרון.
מסקנות
- השיטה מספקת מסגרת חסונה לחקר למידה וזיכרון.
- היא פותחת נתיבים למחקר של טיפולים בבעיות זיכרון הקשורות לגיל.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על פרוטוקול זה כדי לבחון שאלות נוירוביולוגיות שונות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
התנייה של ממצמץ עיניים באמצעות סיגנל מששנתים בעכברים מקובעים בראש מאפשרת בחינה מדויקת של מעגלים עצביים העומדים בבסיס למידה אסוציאטיבית וזיכרון. פלטפורמה זו תומכת בשילוב של כלים גנטיים, אלקטרופיזיולוגיים וכלי דימיון, ובכך מגבירה את הביטחון החזוי בתיקוף של מטרות נוירוביולוגיות בשלבים מוקדמים. גישה זו מקלה על פנוטיפינג התנהגותי חסון וניתן לשחזור, החיוני עבור פורטפוליים של נוירוסיינס תרגומי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר ניתוח מכניסטי של מסלולי למידה וזיכרון באמצעות שימוש בעכברים שעברו שינוי גנטי.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות הגשה מבוקרת של גירויים חושיים ומדידות EMG כמותיות.
- מסייע בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי בידוד תרומותיהם של מעגלים עצביים ספציפיים לתוצאות התנהגותיות.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מספק בדיקה התנהגותית סטנדרטית וניתנת לשחזור להערכת התערבויות מועמדות המשפיעות על למידה אסוציאטיבית.
- מייצר נתוני EMG כמותיים המתאימים להשוואות בין תנאים שונים ולאופטימיזציה של הבדיקה.
- מכין מודלים מתוקפים עם קיבוע ראש עבור תהליכי סינון פרמקולוגיים או גנטיים בהמשך.
מחקר תרגומי ו-Preclinical
- מתואם עם מודלים רלוונטיים למחלות של לקויות זיכרון, ובכך תומך בפיתוח ביומרקרים תרגומיים.
- מאפשר רציפות ממחקרי מנגנונים תאיים ועד לאישור התנהגותי פרה-קליני.
- תומך בקידום מותאם סיכונים של מועמדים לנוירו-תרפיה המכוונים ללקויות בלמידה ובזיכרון.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
שיטה זו מגשרת בין שלבי הגילוי המוקדמים לבין תיקוף פרה-קליני, על ידי מתן אפשרות לבדיקה מונחית-השערה של מנגנונים עצביים בהקשר התנהגותי מבוקר.
- ביולוגיה של גילוי: מאפשר בדיקת השערת האפס והבהרת מסלולים במעגלי למידה אסוציאטיבית.
- סריקה: מספקת פלטי EMG כמותיים הניתנים לשחזור לצורך סטנדרטיזציה של בדיקות והערכת תרכובות.
- אנליטיקה: תומכת בהשוואה סטטיסטית של אמפליטודה וזמן תגובה (latency) של תגובה מותנית בין קבוצות ניסוי.
- מחקר תרגומי: מספקת פלטפורמה להתאמת נקודות קצה התנהגותיות פרה-קליניות עם פנוטיפים קליניים של ליקויי זיכרון.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה מערכת התנהגותית עם קיבוע ראש הניתנת לשימוש חוזר ולהתאמה לשאלות נוירוביולוגיות מגוונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף מטרות ובצמצום סיכונים מכניסטיים למחקרי למידה וזיכרון.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה, השחזוריות והיכולת להרחבה של בדיקות התנהגותיות במודלים שניתנים לטיפול גנטי.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות מסוג go/no-go ואת יעילות ההון על ידי הפחתת סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים.
- השפעה על תיק הפיתוח: מאפשר תיעדוף מותאם סיכונים של תוכניות נוירו-טיפוליות המכוונות לתפקוד קוגניטיבי.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בהשתלה כירורגית, הקלטת EMG ופרוטוקולים של התנייה התנהגותית.
- דורש גישה למכשור לקיבוע ראש, מערכות לרכישת EMG וחומרה לגירוי שפשפים.
- מחייב סטנדרטיזציה קפדנית בין צוותים להענקת גירויים ולתהליכי ניתוח נתונים.
- ניתן להתאמה לרקעים גנטיים שונים ולמניפולציות ניסיוניות בעכברים.
- ניטור קפדני של רווחת בעלי החיים ומינימום של סטרס חיוניים לשמירה על תקינות הנתונים.
