חיידקי עלה הסתננות Assay עבור אפיון פיין של תגובות הצמחים ביטחון באמצעות Thaliana-Pseudomonas ארבידופסיס syringae Pathosystem

המטרה הכוללת של הליך זה היא לאפיין כמותית את התגובה החיסונית של Arabidopsis diliana באמצעות בדיקת חדירת מזרק אופטימלית. זה מושג על ידי שימוש תחילה בהסננת מזרק כדי להעביר ידנית חיידקים לתוך העלה דרך הפתחים הטבעיים הנקראים סאדה. השלב השני הוא השגת דיסקים של רקמת עלים נגועה לאחר התפתחות תסמיני המחלה.

לאחר מכן, החיידקים מופקים מדיסקות העלים באמצעות הומוגניזציה בתפוקה גבוהה. השלב האחרון הוא דילול סדרתי ואיתור על לוחות ספירת חיידקים כדי לספור מושבות. בסופו של דבר, צמיחת חיידקים בתוך כל עלים יכולה להיות בקורלציה עם החוזק היחסי של התגובה החיסונית של הצמח.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום חסינות הצמח, כגון זיהוי גנים התורמים לתגובות הגנה מפני עקה ביוטית. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני השיטה הקיימת הוא בכך שהיא מאפשרת כימות מדויק של גידול הפתוגן ברקמת הצמח הנגוע ומסייעת במניעת טעויות ניסוי הנגרמות מדגימת עלים בעלי מצב התפתחותי מגוון. שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי התגובה החיסונית של הצמח לזיהום עם פתוגן חיידקי אלים, וניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות כגון חומצה סליצילית או דפוסים מולקולריים הקשורים לחיידקים המעוררים תגובות חיסוניות.

בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו להעביר את החיידקים לעלה ללא נזק לרקמות. מדגימים את ההליך הבא חוקר פוסט-דוקטורט הינדי וסטודנטים לתארים מתקדמים שאלו ויאלי. בקרוב מהמעבדה שלי, הבדיקה לרגישות מוגברת למחלות תוצג בסרטון זה.

לפני הניסוי, הכינו את לוחות המדיה של King's B או KB הכינו ליטר אחד של מדיום מוצק KB כמתואר בטקסט הפרוטוקול ותנו לו להתקרר על צלחת ערבוב מגנטית. כאשר המדיה מקוררת למגע ב-80% גליצרול, מגנזיום סולפט טוחנת אחת וסטרפטומיצין למדיה, יוצקים שני גדלים שונים של לוחות מדיה KB. צלחת הפטרי הקטנה יותר משמשת כצלחת תרבית החיידקים העיקרית וצלחת פטרי לחיות מחמד הגדולה יותר משמשת כצלחת ספירת החיידקים.

אחסן את הצלחות בארבע מעלות צלזיוס יומיים לפני פס הבדיקה. PSM ES 43 26. חיידקים ממאגר גליצרול שלילי של 80 מעלות צלזיוס על צלחת תרבית חיידקי סטרפטוקוקוס KB ודוגרים בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס למשך 24 עד 48 שעות למחרת.

התחל את התרבית הנוזלית במבחנה סטרילית עם ארבעה מיליליטר מדיום kb נוזלי המכיל 50 מיקרוגרם למיליליטר סטרפטומיצין. יש לנער 250 סל"ד בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס למשך הלילה. צמחי ה-Arabidopsis לניסוי גדלים בתנאים המפורטים בטקסט הפרוטוקול באותו יום שבו החלה תרבית החיידקים הנוזלית.

סמנו את עלי הכותרת של העלים מספר חמש ושש בטוש קהה ועמיד למים לזיהוי קל של רקמות נגועות בעת הדגימה. כדי לשפר את פתיחת STA ולהקל על כניסת תמיסת פתוגן למי העלים. הצמחים היטב על ידי השריית הדירה מלמטה למשך 20 דקות.

לאחר 20 דקות מסננים את עודפי המים. הזיהום של צמחי הארבידופסיס מתבצע. למחרת התחלת התרבות הנוזלית.

העבירו את תרבית החיידקים לצינור מיקרו צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר וסובבו ב-9, 600 גרם למשך שתי דקות. בטמפרטורת החדר, השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את גלולת החיידקים עם מיליליטר אחד של מגנזיום כלוריד סטרילי של 10 מילי-מולארי מדללים את תרחיף החיידקים עם תשעה מיליליטר של מגנזיום כלוריד 10 מילי-מולרי בצינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר. לאחר מדידת הצפיפות האופטית של החיידקים, יש לדלל את החיידקים במגנזיום כלוריד של 10 מילי-מולרי ל-OD 600 סופי של 0.0002.

לבדיקת זיהום EDS. מזרק ללא מחט בקצה קהה של מיליליטר אחד, הידוע בכינויו מזרק אינסולין משמש להסננה. מלאו את המזרק ב-0.5 עד 0.6 מיליליטר מתמיסת החיידקים המדוללת לשליטה טובה בהרבה בתהליך ההסתננות, אל תמלאו את המזרק במלוא יכולתו.

חשפו את המשטח התחתון של העלה בחלק העליון של האצבע המורה, ולאחר מכן בעזרת האגודל התאימו בעדינות את מיקום העלה. מקם את המזרק אנכית כנגד פני העלה כדי להבטיח פיזור אחיד של הלחץ כדי להפחית את נזקי העלים. נסה להימנע מאזור הצלע האמצעית במהלך ההסתננות.

דחף לאט את הבוכנה כדי לחדור לתמיסת החיידקים. כניסת נוזל למזופיל העלה תוצג כפי שמצוין על ידי צבע העלה הכהה יותר, תחדור לכל פני העלה גם אם היא דורשת ניסיונות מרובים. לאחר השלמת החדירה, נגב בעדינות את העלה ברקמה סופגת כדי להסיר את תמיסת הפתוגן הנוספת.

בדוק ויזואלית את רקמת העלים הנגועה לאיתור נזק. השאירו את הצמחים שחדרו לייבוש למשך שעה עד שעתיים, החזירו את הצמחים לתנאי הגידול המקוריים שלהם. מרססים כיפה שקופה במים ומכסים את הצמחים הנגועים למשך שעתיים.

לאחר מכן סדקו את הכיפה כדי ליצור פתח של שניים עד שלושה סנטימטרים והשאירו אותה דולקת לאורך שארית ניסוי ההדבקה, שהוא בדרך כלל שלושה ימים. יום אחד לפני כימות צמיחת פתוגנים. יבש מראש את לוחות המדיה KB בגודל 150 מילימטר על 15 מילימטר.

יבש את הצלחות על ידי שמירתן בטמפרטורת החדר למשך כ- 24 שעות. עבד את הרקמה הנגועה לאחר הופעת טרשת המצוינת על ידי הצהבה של הרקמה הנגועה בגנוטיפים הרגישים, אך לפני התפתחות נגעים נמקיים. עבור כל גנוטיפ, הכינו שישה צינורות שחיקה.

מניחים כדור טחינה אחד מנירוסטה ומוסיפים 500 מיקרוליטר מגנזיום כלוריד סטרילי ו-10 מילי-מולרי לכל צינור. לאחר מכן, נתק את העלה הנגוע מהצמח ונקב דיסק עלה עם אגרוף נייר עם חור אחד באמצעות מלקחיים באופן אקראי, הנח שני דיסקי עלים משני צמחים שונים לכל צינור טחינה. אטום את הצינורות, הומוגניזציה של הרקמה עם הומוגנייזר תפוקה גבוהה במהירות מקסימלית למשך 10 דקות.

חזור על תהליך זה במידת הצורך עד שהרקמה הומוגנית היטב והתמיסות הופכות לירוקות עקב שחרור כלורופיל מהעלים הנגועים בזמן ההמתנה. לצורך ההומוגניזציה, מלאו כל באר בשש השורות הראשונות של צלחת תרבית של 96 בארות ב -180 מיקרוליטר של מגנזיום כלוריד 10 מילי-מולרי. העבירו 20 מיקרוליטר של מתלה רקמת הקרקע לכל באר בשורה הראשונה של צלחת 96 הבאר וערבבו על ידי פיפטינג חוזר ונשנה של הנוזל למעלה ולמטה.

אם שברי רקמה קטנים סתמו את הקצה, חתכו אותו בשניים עד שלושה מילימטרים כדי לעזור להשיג את הנפח הנכון של התמיסה כדי לספק מספיק מקום לטיפה בחלק העליון של הצלחת לרווח את הרקמה מגנוטיפים שונים בשורות חלופיות. להכנת דילול סדרתי פי עשרה, העבירו 20 מיקרוליטר של תרחיף רקמות לשורה השנייה וחזרו על הליך זה עד לדילול השישי. בעזרת קצות פיפטה מחולקים, העבירו 20 מיקרוליטר מהתמיסה מלוח הקיר 96 על לוחית KB בגודל 150 מילימטר על 15 מילימטר.

עבדו מהמתלה המדולל ביותר למרוכז ביותר, כך שאין צורך להחליף קצות פיפטה בין הדילול. יבש את הצלחת בטמפרטורת החדר כשהמכסה סדוק. ברגע שלא ניתן להבחין בנוזל נוסף על פני הצלחת, סגור את המכסה הפוך ודגר את הצלחת בטמפרטורת החדר.

דגרו על צלחות למשך 40 עד 60 שעות עד שהמושבות נראות לעין. ודא שהחיידקים על הצלחות משקפים את הצפוי פי עשרה. ירידה ביחידות יוצרות מושבה.

ספרו את החיידקים לפני שהם גדלים יתר על המידה והמושבות מתמזגות. קבע את מספר החיידקים בדילול הנמוך ביותר שאין לו מושבות חופפות. בדרך כלל הדילול המועדף לספירה יכיל בין 10 ל-50 מושבות, והוא עשוי להשתנות בין שכפולים טכניים.

כדי לחשב את רמות התפשטות החיידקים, קבע את מספר היחידות היוצרות מושבה לכל דיסק עלה באמצעות נוסחה זו כאשר R הוא מספר השורה ו-T הוא מספר החיידקים בכל שכפול טכני. לאחר מכן משתמשים בנתונים להפקת גרף. כל נקודת נתונים מיוצגת כממוצע של שישה שכפולים טכניים בקנה מידה לוגריתמי.

אירוברים מייצגים את רווח הסמך של 95% של המחלה המוגברת הממוצעת. הרגישות ל-P-S-M-E-S 43 26 הוערכה על ידי זיהום בחיסון עם OD 600 של 0.0002. התוצאות מראות כי למוטציות NPR הרגישות ביותר יש כ-2.5 לוג או פי 300 יותר גידול פתוגנים בהשוואה לצמחי קולומביה אפס מהסוג הפראי.

ניתן לשנות את בדיקת חדירת המזרק כדי להעריך שכבות שונות של תגובה חיסונית. כדי להעריך חסינות המופעלת על ידי חומצה סליצילית, נעשה שימוש ביישום חיצוני של נתרן סליצילאט כדי לעורר את התגובה החיסונית, אשר מכומתת על ידי צמיחת פתוגנים. אובדן NPR R one, המתפקד כקולטן חומצה סליצילית וויסות משותף של שעתוק עיקרי של גני מטרה תלויי חומצה סליצילית מוביל לחוסר רגישות ליישום אקסוגני של נגזרת החומצה הסליצילית.

כדי לאפיין דפוס מולקולרי הקשור לחיידקים שעורר חסינות, צמחים טופלו מראש בשני טריגרים ידועים. FLAG 22 ו-L 18, צמחי קולומביה אפס שטופלו ב-FLAG 22 תמכו בהפחתה של פי 10 או פי 10 באוכלוסיית החיידקים בעוד ששני הצמחים המוטנטיים FLS לא הצליחו להפעיל את אפקט הגבלת צמיחת החיידקים. באופן דומה, הצמחים המוטנטיים EFR לא היו רגישים לטיפול מקדים ב-L 18.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לכמת את התגובה החיסונית של הפסיסה הערבית באמצעות בדיקת חדירת המזרק. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לעקוב אחר התפתחות המחלה ולדגום את הרקמה לאחר הופעת קורסיס. ה-pseudomona pather cul cola S phos 3, 2 6 הוא פתוגן אטרופי של המי.

לפיכך, יש לבצע את הדגימה לפני המעבר לשלב הנוירוטרופי. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו PCR כמותי בזמן אמת וניתוח דם מערבי על מנת לענות על שאלות נוספות כמו איזה מסלול איתות חיסוני מסוים מופרע. אל תשכחו שאתם עובדים עם חיידקים חיים.

למרות ש-Pseudomona Senge אינו פתוגני בבני אדם, אנא זכור להשליך כראוי חומרים מתכלים מזוהמים וצמחים נגועים בעת ביצוע הליך זה.