טומוגרפיה ממוחשבת והדמיה אופטית של צימוד Osteogenesis-אנגיוגנזה להערכת שילוב של Autografts עצם הגולגולת וAllografts
22 בדצמבר 2015
השרשה של שתלי עצם אוטולוגית ואלוגנאית מהווה קיבלה גישות לטיפול באובדן עצם craniofacial גדול. עם זאת, ההשפעה של הרכב שתל על יחסי הגומלין בין neovascularization, התמיינות תאים והיווצרות עצם לא ברורה. אנו מציגים פרוטוקול הדמיה multimodal נועד על מנת להבהיר את התלות ההדדית אנגיוגנזה-Osteogenesis בקרבת השתל.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לעקוב אחר האינטגרציה של שתלי עצם גולגולתיים במונחים של התחדשות עצם וניאו-וסקולריזציה באמצעות גישות הדמיה מולטי-מודאליות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הרפואה הרגנרטיבית, כגון צימוד אנגיוגנזה אוסטאוגנזה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת קביעה תלת מימדית בחדות גבוהה של שלושת כלי הדם, והיא מאפשרת לחקור את האיבר השלם המדגים את ההליך יהיה דורון ויק, דוקטורנט במעבדה שלי לאחר המתת חסד של עכבר ים באב בן שבעה עד שמונה שבועות.
על פי פרוטוקול הטקסט, השתמש בקוצץ שיער כדי לגלח את אזור הגולגולת כנגד כיוון צמיחת השיער. מרחו 70% איזופרופנול על הפגר, ראש לחיטוי. לאחר מכן השתמש באזמל מספר 11 כדי לחתוך את עור הקרקפת ולהסיר את הפריאוסטאום באמצעות מקדחה דנטלית ושיניים בקוטר פנימי של 4.5 מילימטר.
נתק שבר עגול של עצם גולגולתית. העבירו את שבר העצם לצלחת פלסטיק בגודל 100 מילימטר המכילה מי מלח סטריליים. בשלב זה, התבונן בדם וברקמות רכות המחוברות לשבר העצם בעזרת פינצטה מעוקלת.
החזיקו שבר עצם אחד בכל פעם והשתמשו באפליקטור עם קצה כותנה כדי לספוג אותו ביסודיות. הסרת כל רקמת מוח, רקמה רכה ודם. השתמש במספריים עדינים כדי לחתוך בעדינות את כל שבבי העצם שנותרו מחוברים לשתל כך שהשתל יהיה בעל צורה מעוגלת מושלמת.
טבלו כל שתל פעם אחת בשפופרת של 15 מיליליטר המכילה 70% אתנול ופעמיים בצינורות של 15 מיליליטר המכילים PBS כדי לשטוף את האתנול. הקפיאו את האלוגרפט במקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס בצינורות קריו למשך שבוע לפחות לאחר ההקפאה. ודא שהאלוגרפט נראה שקוף בעבודה עם עכברים טרנסגניים נמענים המבטאים לוציפראז בשליטת מקדם האוסטיאוקלצין.
לאחר הרדמת עכברה בת שבעה עד שמונה שבועות באמצעות חומרי הרדמה בהזרקה ואימות טשטוש. השתמש בקוצץ שיער נגד כיוון צמיחת השיער כדי לגלח את אזור הגולגולת. מרחו מסיר שיער כדי להסיר שאריות פרווה והשתמשו בגזה יבשה כדי לנגב אותה לאחר לא יותר משתי דקות.
לאחר מכן השתמש בגזה ספוגה במי מלח כדי לנגב את האזור. חיטוי הקרקפת על ידי מריחת 5% כלורהקסידין תת עורית. הזרקו חמישה מיליגרם לק"ג קרפרופן מדולל ב -200 מיקרוליטר מי מלח.
מרחו משחה לעיניים כדי למנוע יובש והשאירו את החיה על כרית תרמית כל הזמן. לאחר מכן מקם את החיה מתחת למשקפת ההפעלה. לאחר מכן, בעזרת מספריים ופינצטה עדינים, בצע חתך סגלגל באורך סנטימטר אחד בעור הקרקפת בעזרת פינצטה.
החזק את הפריאוסטאום והשתמש במספריים עדינים כדי לחתוך אותו בעזרת מקדחה דנטלית ומקדחה בקוטר חיצוני של חמישה מילימטר tr לחדד את הפגם הקלבריאלי שני מילימטרים לפני תפר הכמבדואיד כדי למנוע חדירה של הדורה מאטר. קדחו שלושה רבעים מהדרך לתוך העצם והשתמשו במרית כדי לנתק את שבר העצם. שלב קריטי אחד בפרוטוקול הוא סיום מיקום הפגם.
פגיעה בתפר הלבה תוביל לדימום מסיבי. לכן, יש להקפיד לא לשבש את מד האורך הבסיסי ואת הסגיטאל העליון. להשתלת שתל אוטומטי.
השתמש ב -10 מיליליטר מי מלח סטריליים בצלחת פלסטיק של 10 מילימטר כדי לשטוף את שבר העצם. הסר קרישי דם מבלי להסיר רקמה רכה כדי להשתיל הפשרת אלוגרפט מראש ולנרמל את הדגימה לטמפרטורת החדר. ואז שוטפים את שבר העצם בפינצטה מעוקלת.
הנח את שתל העצם בפגם כך שהוא לא ייגע בשולי הפגם. לאחר מכן בעזרת ג'ל פיברין, הדביקו את השתל לעצם המארח. לתפור את העור עם ארבעה תפרים של oh Vicryl ולמרוח יוד פובידון על החתך הכירורגי.
סמן את אוזן העכבר והזריק 0.25 מיליגרם לק"ג אנטי סדאן. כדי להפוך את השפעת ההרדמה של המיט. בצע טיפול לאחר הניתוח על פי פרוטוקול הטקסט.
הכן תמיסת מלח הפרינית על ידי שקילת 2000 יחידות נתרן הפרין והעברתו לצינור של 50 מיליליטר. מוסיפים 20 מיליליטר מלח סטרילי לצינור ומנערים. מלאו היטב מזרק נעילת פיתיון של 20 מיליליטר ב-15 מיליליטר של מי מלח מחוממים וחברו את המזרק לסט ורידים בקרקפת בגודל 23.
הצמד את המזרק למשאבת מזרק והגדר את המשאבה ל -10 מיליליטר במיליליטר אחד לדקה. לאחר הרדמת עכבר על פי פרוטוקול הטקסט, אשר את ההרגעה בצביטה בבוהן ואבטח את העכבר. גבו ללוח קיבוע עטוף בתוחם משטח סופג.
לאחר מכן, חותכים את העור מהבטן לצוואר. חותכים את דופן הבטן עד לתהליך ה-xiphoid. לאחר מכן חתכו את כלוב הצלעות לאורך ההיבט הצדדי שלו, וודאו שהלב חשוף לחלוטין והלב והריאות אינם ניזוקים.
השתמש בהמוסטט כדי למשוך את עצם החזה. הכנס את מחט הפרפר שלושה מילימטרים לחדר השמאלי. ואז עם דבק של שלוש שניות, הדביקו את המחט ללב ולדופן החזה החדרת מחט הפרפר לחדר השמאלי היא הליך עדין.
נסה להימנע מהחדרה לחדר הימני או עמוק מדי לחדר השמאלי מכיוון שהוא יחדור לדופן הלב האחורית. לאחר מכן, הפעל מיד את המשאבה. לאחר דקה, נתחו את הווריד הנבוב התחתון על מנת להוריד את לחץ כלי הדם.
הטה את הלוח כך שהנוזלים יזרמו הרחק מהראש. זלוף מוצלח יביא לניקוי הכבד וכלי הדם. כעת הוזל 10 מיליליטר של 4% פורמלדהיד.
הימנעות מחדירת בועות אוויר לכלי הדם. כאשר הזלוף הושלם כפי שמסומן על ידי התקשות הזנב, השתמש ב-10 מיליליטר של מי מלח הפריניים כדי לשטוף את הפורמלדהיד. הכן את חומר הניגוד אטום הרדיו בהתאם להוראות היצרן.
על ידי ערבוב המדלל וחומר הריפוי בצינור פלסטיק, יש להחדיר את החיה עם חומר הניגוד בקצב של מיליליטר אחד לדקה. עורקי המעי הכליליים והכבד צריכים להצהיב עם השלמת הזלוף. חותכים את הצינור למחט הפרפר ועוטפים את הפגר בנייר כדי למנוע דליפה של התמיסה לאזור הגולגולת.
הניחו את החיה בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי לאפשר פילמור למחרת. כדי לנתח את אזור הגולגולת, השתמש באזמל כדי לחתוך את העור לרוחב ככל האפשר, והימנע מפגיעה באזור הגולגולת המבוקש. אתר את שתל העצם ולאחר מכן השתמש במספריים עדינים כדי לחתוך את עצם הגולגולת במרחק של 10 מילימטרים מהשתל.
באמצעות סורק מיקרו CT. הגדר את שדה הראייה ל-20.5 מילימטרים, אנרגיית רנטגן לעוצמה של 55 KVP ל-145 מיקרו-אמפר, אלף הקרנות לכל 360 מעלות וזמן אינטגרציה של 200 אלפיות השנייה. סרוק את דגימת העצם הגולגולתית המבודדת.
התבונן בפרוסות המשוחזרות הדו-ממדיות שנוצרו על ידי תוכנת המיקרו CT. הקפד לסרוק את אזור העניין כראוי ולאחר מכן לאתר את הפגם הקלוריאלי. אם ניתן לזהות בקלות את הכלים המועברים, השתמש בחומצה טריכלורואצטית 6% מדוללת במים מזוקקים כפולים.
כדי להסיר את הדגימה, סרוק מחדש את הדגימה באמצעות אותם פרמטרים שתוארו זה עתה. אתר את תפר הכמבדואיד בפרוסות הדו-ממדיות המשוחזרות. הגדר נפח גלילי מעניין או VOI בגובה שני מילימטרים ובקוטר של שמונה מילימטרים המשיק לתפר.
זהו האתר האנטומי של הפגם. לאחר מכן פלח את העצם מהרקמה הרכה. הגדר את הסף התחתון ל-130 והחל מסנן גאוס תלת-ממדי מוגבל כדי לדכא חלקית רעש באמצעי האחסון
צור שחזור תלת מימדי. ודא שה-VOI ממוקם כראוי באמצעות תוכנת IPL ואובייקט ה-DT. פונקציית Peram יוצרת מפת עובי.
פונקציה זו מתארת את נפח הכלי עבור כל קוטר כלי מבצע הדמיה וטומוגרפיה ממוחשבת מיקרו. על פי פרוטוקול הטקסט, כפי שמוצג כאן, שבעה ימים לאחר הניתוח, סריקת CT הדגימה נפח גבוה משמעותית של כלי דם בקוטר קטן ובינוני שהזינו את כל אזור השתל בעכברים שקיבלו חתימות לעומת עכברים שקיבלו השתלות שבהן נראה היה שהכלים חודרים מבחוץ. בנוסף, הדמיה פלואורסצנטית הראתה זלוף דם גבוה משמעותית בבעלי חיים שטופלו בחתימה.
ביום ה-14, עץ כלי הדם באלוגרפט מגיע לכל קרבת השתלים. עם זאת, נפח כלי השיט היה נמוך משמעותית בהשוואה לקבוצת אוטוגרף. הבדל זה היה בולט ביותר כאשר כלי דם בקוטר של 0.08 עד 0.1 מילימטר הושוו כפי שניתן לראות כאן 28 ימים לאחר הניתוח, נפח כלי הדם חזר לנקודת ההתחלה שבעה ימים לאחר הניתוח.
קבוצת ההשתלה האוטומטית הדגימה מינרליזציה גדולה יותר של העצם באופן משמעותי כפי שניתן לראות על ידי הדמיה פלואורסצנטית באמצעות בדיקה מכוונת הידרוקסיאפטיט. עצם שנוצרה לאורך קרבת השתל בקבוצה זו בעוד שהיא נוצרה רק בשולי הפגם בקבוצת האלוגרפט כפי שסומן בצורת טבעת 56 ימים לאחר הניתוח, נפח העצם היה גבוה משמעותית ועובי השתל היה גדול משמעותית בבעלי חיים שקיבלו חתימות לעומת השתלות לאחר שליטה, טכניקה כירורגית זו יכולה להיעשות תוך כ-25 דקות. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע הדמיה פלואורסצנטית באמצעות בדיקות אחרות על מנת לענות על שאלות נוספות, למשל, פעילויות אוסטאוקלסטים ומעורבות של תגובה חיסונית.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לדמות התחדשות עצם באנגיוגנזה הבסיסית.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג פרוטוקול דימוי רב-מודאלי לבחינת השתלבות של השתמרות עצם גולגולת, תוך התמקדות במערכת היחסים בין נאו-וסקולריזציה (יצירת כלי דם חדשים) לבין התחדשות עצם. הטכניקה שואפת להבהיר את הזיקה בין אוסטאוגנזה לאנגיוגנזה בטיפולים לאובדן עצם קרניו-פציאלית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- רפואה רגנרטיבית
- ביולוגיה של העצם
רקע
- השתלת עצם היא שיטה נפוצה לטיפול באובדן עצם קרניו-פציאלי.
- השפעת הרכב השתל על תהליכי ריפוי העצם אינה מובנת דיה.
- הבנת התלות ההדדית בין אנגיוגנזה לאוסטאוגנזה היא קריטית לשיפור תוצאות השתלה.
- דימות רב-מודאלי יכול לספק תובנות לגבי תהליכים ביולוגיים אלו.
מטרת המחקר
- לניטור השתלמות הש grafted של עצם הגולגולת.
- להערכת התחדשות העצם ונאו-וסקולריזציה (יצירת כלי דם חדשים).
- לבחינת הזיקה שבין אוסטאוגנזה לאנגיוגנזה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- שימוש בטכניקות דימות מולטימודליות לוויזואליזציה תלת-ממדית ברזולוציה גבוהה.
- הכנה של אזור הגולגולת בעכברי ים מסוג Bab להשתלת גרפה.
- שימוש באיסופרופנול לחיטוי לפני הניתוח.
- שימוש במקדח דנטלי להסרת הפריאוסטום.
תוצאות עיקריות
- דימיון ברזולוציה גבוהה מאפשר תצפית מפורטת על מבנים וסקולריים.
- ניתן להעריך כמותית את השילוב של השתמרים.
- התקבלו תובנות לגבי הקשר בין היווצרות כלי דם לבין צמיחת עצם.
- השיטה מדגימה פוטנציאל לקידום מחקרים ברפואה רגנרטיבית.
מסקנות
- דימות מולטי-מודאלי יעיל לחקר השתבשות של השתמרות עצם גולגולת.
- הממצאים משפרים את ההבנה של הצימוד בין אנגיוגנזה לאוסטאוגנזה.
- מחקר זה עשוי להוביל לאסטרטגיות משופרות לטיפול באובדן עצם קרניו-פציאלי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
גישת הדמיון הרב-מודאלית זו מאפשרת הערכה כמותית של הזיקה בין אוסטאוגנזה לאנגיוגנזה, גורם קריטי באינטגרציה של השתקת עצם ובתוצאות של רפואה רגנרטיבית. על ידי אספקת נתונים תלת-ממדיים ברזולוציה גבוהה של ה vasculatrue ושלהיווצרות עצם, השיטה תומכת בתיקוף מטרות (target validation) ובצמצום סיכונים מכניסטיים במחקרי ריפוי עצם פרה-קליניים. היא מספקת ערך ניבוי להערכת יעילות השתקה ולסיוע בקבלת החלטות של go/no-go בפיתוח טיפולים אוסטאואינדוקטיביים.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות באמצעות כימות של פרפוזיה וסקולרית ומינרליזציה של העצם כנקודות סיום מצומדות.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות דימות אורך של דינמיקת האנגיוגנזה והאוסטאוגנזה.
- ערך ניבוי: תומך במיון תיקי פיתוח על ידי זיהוי השתמות בעלות פרופילים עדיפים של נאו-וסקולריזציה ויצירת עצם.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: הכנת מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף להערכה של תרכובות בשלבים הבאים, תוך שימוש בפרוטוקולי דימוי סטנדרטיים.
- תוצרי מדידה כמותית: יצירת מדידות הדירות של נפח כלי דם, פרפוזיה של דם ומסלביות העצם לצורך אופטימיזציה של הבדיקה.
- שימוש חוזר בפלטפורמה: מאפשר סריקה ניתנת להרחבה של חומרים בעלי השפעה אוסטאו-אינדוקטיבית באמצעות מדדי כלי דם ועצם עקביים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מדמה אובדן עצם קרניו-פציאלי אנושי כדי לחקור אינטגרציה של השתלה במארח במערכת הרלוונטית למחלה.
- המשכיות תרגומית: מקשר בין מדדי כלי דם ועצם משלב הגילוי לבין תיקוף פרה-קליני של טיפולים רגנרטיביים.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מבהיר את הצימוד בין אוסטאוגנזה לאנגיוגנזה כדי להפחית אי-ודאות ביולוגית במועמדים מובילים.
שילוב תהליכי עבודה (Pipeline & Workflow Integration)
השיטה משתלבת לאורך רצף הגילוי, ותומכת בבדיקת השערות בשלבי גילוי מוקדמים, בסטנדרטיזציה של בדיקות (assays) בסריקה ובתיקוף מנגנוני בשלבים פרה-קליניים.
- ביולוגיה של הגילוי: מאפשרת בחינה של מסלולים אוסטאוגניים ואנגיוגניים באמצעות מדדים רב-מודאליים.
- סריקה: מבטיחה הדירות של הבדיקה באמצעות פרמטרים סטנדרטיים של דימוי ופרפוזיה של חומרי ניגוד.
- אנליזה: מספקת מדדים כמותיים של כלי דם ועצם המאפשרים ניתוח השוואתי של תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין תוצרי הדימוי להחלטות על התקדמות פרה-קלינית המבוססות על יצירת עצם מvסוכלית.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמת דימוי הניתנת לשימוש חוזר להערכה של חומרי השתלה מרובים ומועמדים טיפוליים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי על ידי הפחתת העמימות המכניסטית ביעילות השתבת העצם.
- ערך תפעולי: מספק סטנדרטיזציה, שחזוריות ויכולת הרחבה (scalability) על פני סוגי השתבתיות ונקודות זמן שונות.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות go/no-go, יעילות הון, ומפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים בתוכניות רגנרטיביות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכונים המבוסס על ספי בקוונטיות של התווספות כלי דם ויצירת עצם.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרו-כירורגיה, בטכניקות פרפוזיה ובתפעול של דימות מולטי-מודאלי.
- תלוי בסורקי microCT, במערכות דימות פלואורסצנציה וביולומינצנציה, ובהכנת חומרי ניגוד.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולים כירורגיים, פרוטוקולי פרפוזיה ופרוטוקולי דימות.
- כולל שיקולי התאמה בין מודלים עכבריים וסוגי השתמה (השתמה עצמית לעומת השתמה מאחר).
- כולל מגבלות מעשיות כגון מורכבות כירורגית, דיוק בפרפוזיה ודרישות לדימות לאורך זמן.
