ניתוח מבוסס Cytometry Imaging- והזרימה של עמדת תא ומחזור התא בSpheroids מלנומה 3D
28 בדצמבר 2015
אנו מתארים שתי שיטות משלימות המשתמשות באינדיקטור מחזור התא של הפלואורסצנציה (FUCCI) וניתוח תמונה או ציטומטריית זרימה כדי לזהות ולבודד תאים באזורי העצירה הפנימיים של G1 ובאזורים החיצוניים המתפשטים של ספרואידים תלת מימדיים.
המטרה הכוללת של שיטה זו היא לזהות, לאפיין ולבודד תאים מסטרואידים רב-תאיים ביחס למצב מחזור התא שלהם ומיקומם בתוך הסטרואיד בהשוואה לתרבית תאים דו-ממדית. מודל ה-OID התלת-ממדי מסכם את הביולוגיה של סרטן in vivo כאשר הוא מחקה את ארכיטקטורת הגידול ואת המיקרו-סביבה שלו על ידי זיווג ספרים עם ציטומטריית זרימה וטכניקות הדמיה. שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח בתחום הסרטן, כגון כיצד מיקרו-סביבת הגידול משנה את הרגישות לתרופות, תנועתיות התאים והתפשטותם.
היתרון העיקרי של שיטה זו הוא שהיא מאפשרת הדמיה בזמן אמת של מחזור התא והיא מאפשרת טיהור של תאים חיים מאזור סטרואידים ספציפי המדגים שההליך ייעשה חד, עוזר מחקר מהמעבדה שלנו התחל להתכונן להיווצרות סטרואידים תלת מימדית על ידי מיקרוגל 1.5% aros ב-100 מיליליטר של תמיסת מלח איזון של האנק או HBSS או שלוש עד חמש דקות לסירוגין לסובב את הבקבוק כדי להבטיח שה-AROS התמוסס לחלוטין. לאחר מכן מיד פיפטה 100 מיקרוליטר מתמיסת הארוס לכל באר של צלחת תרבית רקמות שטוחה עם תחתית 96. דגרו את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך שעה כדי לאפשר לארוס להתמצק.
לאחר מכן, הסר תרבית תאי מפגש של 80% של תאי מלנומה המבטאים את מבני ה-FCI מאינקובטור תרבית התאים. שוטפים את התאים עם 10 מיליליטר HBSS. הוסף 1.5 מיליליטר של 0.05% ב-EDTA ולאחר מכן דגר על התאים ב-37 מעלות צלזיוס למשך כשתי דקות.
לאחר שהתאים ניתקו את הרסוס, השעו אותם ב-10 מיליליטר של תרבית תאים. בינוני. ספרו ידנית את התאים באמצעות המו, ציטומטר ומיקרוסקופ הפוך ודללו אותם ל-25,000 תאים למיליליטר במדיום תרבית תאים. לאחר מכן פיפטה 200 מיקרוליטר של מתלה התא כדי לכסות כל באר של צלחת 96 הבארות.
דגרו על הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך כשלושה ימים ליצירת ספרואידים של תאים. לאחר תמונת הדגירה הספרואידים במיקרוסקופ הפוך באמצעות מטרת מט"ח ומסנן ניגודיות פאזה. ספרואידים צריכים להופיע כאגרגטים קומפקטיים וכדוריים בערך כדי להכין את סטרואיד התא לחתך והדמיה.
השתמש בפיפטה של מיליליטר אחד כדי להעביר אותם לצינור בז. לאחר מכן אפשר לסטרואידים להתיישב בתחתית החרוט. לאחר מכן, הסר את היניקה הדו-צדדית הבינונית ולאחר מכן תקן את הספרואידים על ידי דגירה שלהם בפורמין ניטרלי של 10% למשך שעתיים לפחות בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן ניתן לאחסן SP ב-HBSS בארבע מעלות צלזיוס למשך מספר ימים לאחר חתך והדמיה של התא. Sphe פתח את תוכנת ניתוח התמונה ובחר את תצורת הכימות בלבד. לאחר מכן צור ספרייה חדשה וייבא את קובץ התמונה הקונפוקלי הספרואיד על ידי גרירת קובץ הנתונים הגולמי לספרייה.
לאחר מכן, עבור ללשונית המדידות כדי לבנות פרוטוקול ניתוח תמונה על ידי גרירה ושחרור של פקודות בסדר הנכון בחלון הפרוטוקול. כדי לחפש אובייקטים בערוץ הירוק, גרור ושחרר את הפקודה חפש אובייקטים ממקטע החיפוש לחלון הפרוטוקול ובחר את הערוץ המתאים. הוסף פקודה פתוחה שנמצאת בעיבוד ולאחר מכן הוסף פקודה נפרדת של נגיעה באובייקטים כדי להפריד בין התאים.
לבסוף, מקטע הסינון, הוסף ואל תכלול אובייקטים לפי גודל. פקודה עבור אובייקטים קטנים מ-50 מיקרומטר כדי לא לכלול עצמים קטנים שאינם תאיים. לאחר מכן, גרור ושחרר פקודת חיפוש אובייקטים חדשה לחלון הפרוטוקול.
בצעו את אותם צעדים, בחרו בערוץ האדום והחילו את כל הפקודות הבאות. לאחר מציאת אובייקטים, השתמש בפקודות הסתר ערוץ או הצג ערוץ כדי לוודא חזותית שאובייקטים אדומים וירוקים תואמים לגרעינים אדומים וירוקים. במידת הצורך, לחץ על אפשרויות מדידות ולאחר מכן משוב כדי לשנות את המראה של מסיכות האובייקט.
כעת כדי למצוא אובייקטים צהובים התואמים לתאי שלב S מוקדמים, השתמש בפקודת ההצטלבות שנמצאת בקטע השילוב ובחר הצטלבות אובייקטים אדומים עם אובייקטים ירוקים. שוב, אל תכלול אובייקטים לפי גודל של פחות מ-50 מיקרומטר. לזיהוי תאי G חד-פאזיים, השתמשו בפקודה 'חיסור' שנמצאת באזור השילוב ובחרו 'הפחת עצם צהוב מעצמים אדומים' כדי למצוא עצמים אדומים בלבד.
באופן דומה, הפחיתו אובייקטים צהובים מעצמים ירוקים על מנת לזהות אך ורק עצמים ירוקים הקשורים לתאי פאזה SG two ו-MPH הן עבור האובייקטים האדומים והן הירוקים בלבד. הסר אובייקטים שאינם תאיים לפי הצורך על-ידי החלת פקודת אוכלוסיית מסנן ממקטע הסינון עם גורם צורה גדול מ- 0.25. לאחר מכן מצא את מתאר הכדור S.
שימוש בפקודה 'חפש אובייקטים' מאזור החיפוש בערוץ הירוק או האדום. השתמש בפקודה סגורה ממקטע העיבוד כדי לצרף את התאים הבודדים לאובייקט אחד. לאחר מכן הוסיפו פקודת מילוי חורים בעצמים למילוי חורים בכדור.
לאחר מכן, השתמש במסנן עדין כדי להסיר רעש מאובייקט Sphero. סיים למצוא את קווי המתאר הספרואידים על-ידי בחירה באפשרות אל תכלול אובייקטים לפי גודל כדי להסיר אובייקטים קטנים מ- 30, 000 מיקרומטר. לאחר הגדרת כל האובייקטים, הוסף מרחקי מדידה מהקטע הקשור כדי לקבוע את המרחק מכל OID לקצה מתאר הכדור S.
עשו זאת בכל אחת מהאוכלוסיות הצהובות, האדומות והירוקות בלבד. כדי להמחיש את המרחקים המינימליים מהתא לקצה הספרואיד הקרוב ביותר של S, פתח את הכרטיסייה מדידות ובחר אפשרויות משוב ואחריו קשרים. לאחר מכן בחר הצג מרחקים.
לבסוף, שמור את הפרוטוקול כדי לשמור נתונים שנוצרו על-ידי הפרוטוקול. בחר את פריט המדידה מקטע המדידה. לאחר מכן כדי לפרש את הנתונים, בחר את פריט המדידה, עבור ללשונית הניתוח בקטע המדידה ובחר נתח תחת תפריט הניתוח כדי לספור את התאים שנמצאו במרחק מסוים מקצה הסטרואידים.
צור מסנן על-ידי בחירת מסנן מכרטיסיית הניתוח. לדוגמה, הצג רק נתונים שבהם המרחק מקצה הכדור קטן מ- 100 מיקרון. כדי לייצא את הנתונים הגולמיים, בחר ייצוא מכרטיסיית הקובץ ולאחר מכן שמור את הנתונים כטקסט מופרד באמצעות פסיקים או כטקסט מוגבל באמצעות טאבים.
ניתן לפתוח נתונים אלה בתוכנת גיליון אלקטרוני להמשך ניתוח. כדור תא שנוצר מ-C 8 1 16 1. תאי מלנומה אנושיים שהומרו במערכת פוג'י תוקנו וחתכו.
בוצעה הדמיה קונפוקלית עבור AZA ירוק, המסמנת תאים בשלב SG 2M של מחזור התא וכתום ברה, המסמן תאים בשלב G אחד. כאשר תמונות אלה מכסות, ניתן לצפות בתכונות מפתח כגון ליבה נמקית כצפוי. תאי G אחד אדומים שנעצרו שולטים קרוב יותר לליבה הנמקית הזו בעוד שתאים אדומים וירוקים מתרבים גדלים בצורה שיפועית לכיוון הקצה החיצוני של הסטרואיד או הגישה לחמצן וחומרים מזינים היא הגדולה ביותר.
לאחר ניתוח תמונה אוטומטי למחצה, ניתן להגדיר את מסכות תאי הפוצ'י ואת קווי המתאר של S spheroid. תוכנת הדמיה שימשה לכימות תאים אדומים וירוקים באזור הפנימי או החיצוני של הספרואיד S. ניתוח זה הראה כי תאי מעצר שלב G אחד מועשרים באזור הפנימי בעוד שתאים מתרבים שולטים קרוב יותר לקצה הסטרואידים.
לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שבוע עד שבועיים, מסגרת זמן הכוללת גידול סטרואידים, הדמיה וניתוח. לאחר הליך זה ניתן להשתיל ראדים במטריצת קולגן ולאחר מכן לדמות באמצעות מיקרוסקופ TimeLapse. לאחר מכן הם יכולים להיות נתונים לניתוח חלבון או RNA, וזה יכול לעזור לנו לענות על שאלות כמו האם מיקום בסטרואידים וגישה לחמצן וחומרים מזינים יכולים לשנות פנוטיפים של תאים סרטניים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג שתי שיטות משלימות המשתמשות במדד מחזור התא הפלואורסצנטי לעובקיטינציה (FUCCI) לצד ניתוח תמונות וציטומטריית זרימה. טכניקות אלו נועדו לזהות ולבודד תאים על בסיס מצב מחזור התא שלהם בתוך ספרואידים תלת-ממדיים (3D spheroids).
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של התא
- מחקר סרטן
- תרבית תאים בתלת-ממד
רקע
- ספרואידים בתלת-ממד מדמים את ארכיטקטורת הגידול ואת הסביבה המיקרוסקופית שלו.
- הבנת מצב מחזור התא היא קריטית למחקר סרטן.
- תרביות דו-ממדיות מסורתיות אינן מייצגות במדויק תנאים in vivo.
- ציטומטריה של זרימה וטכניקות דימוג משפרות את יכולות הניתוח.
מטרת המחקר
- לזיהוי ואפיון של תאים בשלבים שונים של מחזור התא.
- לבידוד אוכלוסיות תאים ספציפיות מספרואידים תלת-ממדיים (3D).
- לבחינת השפעת הסביבה המיקרוסקופית של הגידול על התנהגות התאים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- מדד מחזור תאים פלואורסצנטי לעיקביטיניציה (FUCCI) לצורך ויזואליזציה.
- ניתוח תמונות להערכת מצב מחזור התאים.
- ציטומטריה זרימה לבידוד תאים.
- הכנת ספרואידים בתלת-ממד באמצעות מערכות סיבוב (aros) בצלחות לתרבית רקמה.
תוצאות עיקריות
- זיהוי מוצלח של תאי פנימיים העצורים בשלב G1 ותאים חיצוניים בשלב proliferated.
- השגת ויזואליזציה בזמן אמת של דינמיקת מחזור התא.
- הדגמת בידוד של תאים חיים מאזורים ספציפיים של ספרואידים.
- תובנות לגבי האופן שבו מיקרו-סביבת הגידול משפיעה על רגישות לתרופות ועל proliferated.
מסקנות
- השיטות מספקות גישה חסונה לחקר הביולוגיה של הסרטן.
- ניתוח בזמן אמת משפר את ההבנה של התנהגות תאים במודלים בתלת-ממד.
- טכניקות אלו יכולות להנחות אסטרטגיות טיפוליות בטיפול בסרטן.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הבנה של ההומוגניות המרחבית בספרואידים של גידולים מאפשרת הפחתת סיכונים מכניסטית של תיקוף מטרות, על ידי קישור מצב מחזור התא לרמזים מהסביבה המיקרוסקופית. גישה זו תומכת בביטחון חיזוי במודלים פרה-קליניים באמצעות כימות של מדרגי פרוליפרציה ונישות שקטות (quiescent niches) הרלוונטיות לחדירת תרופות ולהתנגדות לטיפול. היא מסייעת במיון הפורטפוליו על ידי זיהוי תתי-אוכלוסיות בעלות הסבירות הגבוהה ביותר להוביל לחזרה של המחלה או לבריחה תרפיתית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות באמצעות מיפוי של מעצר בשלב G1 ושל פרוליפרציה באזורי הספרואיד, ובכך מבהיר תלויות של מסלולים באזורים היפוקסיים לעומת אזורים עשירים בחומרי הזנה.
- ערך תפעולי: מאפשר בידוד של תאים חיים מאזורים מוגדרים לצורך בדיקות תפקודיות המשך, ובכך מפחית עמימות מכניסטית במחקרי מעורבות של מטרה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: הכנה של מערכות ביולוגיות מתיקים עם מדדי מחזור תא כמותיים לסריקת תרכובות, להבטחת רלוונטיות של הבדיקה למבנה תלת-ממדי.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של פלטים מרחביים ופנוטיפיים באמצעות ניתוח תמונות, לשיפור השחזוריות לאורך קמפיינים של סריקה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: תואם למערכות הרלוונטיות למחלה על ידי מידול של מדרגי נמק, שקיטות ושגשוג הנצפים in vivo.
- ערך תפעולי: תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון על ידי קישור פנוטיפים תלויי-מיקום לגורמי עקה של המיקרו-סביבה.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
השיטה משתלבת בביולוגיה של גילוי על ידי מתן אפשרות לבדיקת השערות לגבי השפעות של מיקרו-סביבה על מחזור התא, ממשיכה לסריקה באמצעות בדיקות סטנדרטיות המבוססות על ספרואידים, ותומכת במחקר תרגומי באמצעות יישור סממנים ביולוגיים עם רזולוציה מרחבית.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת היפותזות על ידי קורלציה בין מיקום התא לשלבי מחזור התא, כדי להבהיר את מנגנוני התגובה לתרופות.
- סריקה: מספק מוכנות לבדיקה באמצעות יחסים כמותיים של תאים אדומים/ירוקים באזורים הפנימיים והחיצוניים של הספרואיד, מה שמאפשר מעקב אחר השפעת תרכובים.
- אנליטיקה: מספק מדידות של המרחק מהקצה ומסכות ספציפיות לשלב מחזור התא כפלט כמותי להשוואת תנאים.
- מחקר תרגומי: מקשר לרצף פרה-קליני על ידי מידול מדרגי חמצן/חומרי תזונה המשפיעים על פנוטיפים של תאי סרטן.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה לשימוש חוזר עבור מעקב אורך של חיוניות תאים, ביטוי גנים או תגובה לתרופות על פני מספר דורות של ספרואידים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון ניבויי באמצעות רזולוציה מרחבית של שגשוג ושקיטות, המפחיתה תוצאות חיוביות שגויות בתיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה ויכולת הרחבה באמצעות ניתוח תמונות חצי-אוטומטי ובידוד באמצעות ציטומטריה של זרימה.
- ערך אסטרטגי: קבלת החלטות משופרת לגבי המשך פיתוח (go/no-go) על ידי הפחתת סיכונים במטרות בהתבסס על תגובתיות לסביבה המיקרוסקופית.
- השפעה על הפורטפוליו: תיעדוף מותאם-סיכון של תרכובות חודרות נישות שקטות או כאלה המכוונות לתאים במחזור.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטרנסדוקציית FUCCI, תרביות ספרואידים ודימוג קונפוקאלי.
- תלוי במיקרוסקופיה פלואורסצנטית ובתוכנה לניתוח תמונות המסוגלת לביצוע סגמנטציה של ערוצים וסינון מורפומטרי.
- מחייב סטנדרטיזציה בין קווי תאים ותנאי מטריקס להשגת יצירת ספרואידים הדירה.
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום על מערכות של תרביות משולבות (co-culture) של סטרומה או תאים שאינם מלנומה.
- מוגבל על ידי עומק החיתוך וחדירות האות בספרואידים גדולים יותר, דבר המשפיע על הרזולוציה של אזור הליבה.
