כמותי הפונדוס autofluorescence עבור הערכת מחלות רשתית
11 במרץ 2016
אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) תומך ברשתית התחושתית, באמצעות מיחזור תוצרי לוואי של מחזור הראייה, המצטברים כליפופוסין. מוצרים אלה הם אוטו-פלואורסצנטיים וניתן לצלם אותם באופן איכותי in vivo. כאן, אנו מתארים שיטה להדמיה כמותית של ליפופוסין RPE באמצעות אופטלמוסקופיה בלייזר סריקה קונפוקלית.
המטרה הכוללת של אוטופלואורסצנציה כמותית, או qAF, היא להעריך את הרמה הכוללת של ליפופוסין בתאי התמיכה של הרשתית, אפיתל פיגמנט הרשתית, או RPE, בעיניים בריאות וחולות כאחד. טכניקה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בביולוגיה של תאי הרשתית, כגון כיצד בריאות אפיתל הפיגמנט ברשתית מקיימת אינטראקציה עם התפתחות של ניוון מקולרי הקשור לגיל, או AMD. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת קביעת רמות אבסולוטיות של אוטופלואורסצנטיות ליפופוסין בפונדוס, ולכן מעקב כמותי ורבייתי בין מטופלים, בין מפגשי הדמיה של מטופלים ובאוכלוסיות מחקר גדולות.
לפני ההדמיה, הגדר כראוי אופטימוסקופיה לייזר סריקה קונפוקלית, או CSLO, לרכישת נתונים בהתאם להוראות היצרן. כדי להרכיב ייחוס פלואורסצנטי פנימי, שנרכש מהיצרן, סובב את העדשה כדי להסיר אותה, פתח את טבעת המתכת של המכונה והחלף אותה בטבעת המתכת החדשה המכילה את ההפניה. חיוני להרחיב את האישונים ל-6 מ"מ לפחות למעבר אור ללא הפרעה.
עם 0.5% טרופיקמיד, ו-2.5% פנילפרין, יש להרחיב את האישונים של המטופל ב-6 מ"מ לפחות, דבר חיוני למעבר אור ללא הפרעה כדי לראות ולמדוד את הפונדוס. מקם כראוי את המטופל על ה-CSLO כשהסנטר מונח על משענת הסנטר, המצח מונח כנגד משענת המצח, וקאנטי לרוחב מיושר כראוי עם המחוונים. כדי להשיג תמונות בסיסיות, דמו תחילה את הפונדוס עם החזר אינפרא אדום כמעט, או אור IR, על מנת לרכז את המצלמה מעל המקולה ולהשיג מיקוד גס.
כאשר המטופל ממוקם כראוי, העבר את הגדרת החומרה בלוח הבקרה למצב הדמיית IR, מקם את המצלמה באופן ידני עד שהפונדוס יהיה במיקוד מלא וצלם תמונה. התאם את ההגדרה בלוח הבקרה ל-IROCT, המשתמש בטומוגרפיה קוהרנטית אופטית בתחום הספקטרלי, או SDOCT, בשילוב עם הדמיית IR, כדי להעריך את המקולה למחלה בסיסית. השתמש במדריכים הקיימים בחלון ההדמיה כדי לכוון נכון את ה-OCT לתמונת ה-IR של הפונדוס.
כדי להשיג איכות SDOCT מיטבית, מקם את המצלמה כך שתמונת ה-OCT תהיה בשליש העליון של חלון ההדמיה שלה. רכוש לפחות סריקת קו אופקי אחת דרך הגומה המרכזית, ומשתרעת על פני כל שדה ההדמיה. כדי להגדיר הדמיית qAF, השתמש ברכישת תמונות במהירות גבוהה, מה שמפחית את הסיכון לאובדן אות עקב תנועת המטופל, וחסימת אור על ידי קשתית או עפעפיים.
השתמש בממוצע של 9 פריימים, הלוכד במהירות וברצף תשע מסגרות תמונה שלאחר מכן מחושב בממוצע כדי להפחית רעש וחפצים. בחרו שדה של 30 x 30 מעלות, המתייחס לדרגות שטח הרשתית שנלכדו במהלך רכישת התמונה. לאחר אזהרת המטופל על האור הכחול, הפעל את מצב המיקוד האוטומטי ויישר את ציר המצלמה כך שהמסך יתמלא בצורה מקסימלית ב-AF פונדוס, עם החשכה מינימלית של דפנות ופינות התמונה.
אם המטופלים מתקשים לסבול את האור הכחול הבהיר, הרחיקו את המצלמה מהעין כדי להתחיל לצלם, והביאו את המצלמה לאט לכיוון המטופל עד שהפונדוס נראה במלואו. באופן ידני או עם ג'ויסטיק האופטמוסקופ, כוונן את יישור המצלמה על ידי הזזת ה-CSLO כדי למקם מחדש את המצלמה כך שאות ה-AF יהיה ברמה הגבוהה ביותר שלו בכל השדה, במקום להשיג את התמונה החדה ביותר. במהלך רכישת תמונה, פיקסלים צבעוניים הנראים בייחוס הפנימי או בפונדוס מצביעים על רוויה יתר, ובכך על אובדן האות.
חשוף את הרשתית במלואה לאור מיקוד אוטומטי למשך 20 שניות לפחות כדי למזער את ספיגת האור על ידי רודופסין ברשתית התחושתית, במהלך ההדמיה. השתמש בתקופה זו כדי למטב את היישור, המיקוד והרגישות של המצלמה. בקש מהנושאים למצמץ לפני כל קבלת תמונה, מכיוון שסרט דמעה טרי משפר את איכות האות.
הימנע מעפעפיים במישור הרכישה וצלם את התמונה. חשוב להפיק לפחות שתי תמונות באיכות גבוהה בכל הפעלת הדמיה לניתוח נתונים. בצע עיבוד לאחר תמונה באמצעות תוכנת CSLO כדי לחשב את הממוצע של ערימת תשע הפריימים, כדי להגדיל את יחס האות לרעש.
בצע ניתוח תמונה על פי פרוטוקול הטקסט. כפי שמוצג כאן, בעיניים בריאות, AF הנפלט מה-RPE מפוזר באופן אחיד יחסית בכל הפונדוס. עוצמה מופחתת נראית באזור המקולרי המרכזי עקב חסימת האור על ידי פיגמנט מקולרי, ובצדדים ובפינות עקב האופטיקה של העין והמצלמה.
כלי השיט צריכים להיות כהים ובמיקוד ברור. איור זה מייצג הצגת מפת חום מקבילה של רמות ה-qAF מאיור זה. צבעים קרים יותר מתאימים לאזורים בעלי עוצמת מיקוד אוטומטי נמוכה יותר, בעוד שצבעים חמים יותר מתאימים לאזורים בעלי עוצמת מיקוד אוטומטי גבוהה יותר.
עוצמה מקסימלית נראית בדרך כלל בטבעת שמונה המקטעים הקונצנטרית השנייה, והעוצמות הממוצעות באזור זה משמשות לרוב ניתוח הנתונים. מוצג כאן ניתוח מייצג של העין עם AMD, המדגים אטרופיה גיאופגרפית, צורה מתקדמת של AMD. צורה זו של AMD גורמת לאזורים מקומיים של אובדן RPE, המעיד על ירידה ניכרת או היעדר AF, וגורמת לאובדן ראייה מרכזי מתקדם.
בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לבחור מטופלים מועמדים בקפידה ולקבל תמונות באיכות גבוהה כדי למקסם את איכות הנתונים. שימוש בהליך זה יכול לאפשר מעקב אורכי אחר בריאות הרשתית כדי לקבוע את התקדמות ניוון הרשתית. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום האופטימולוגיה לעקוב ולנתח ניוון רשתית.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש באוטופלואורסצנציה כמותית כדי להעריך את המטופלים שלך עם ניוון רשתית. תודה על הצפייה, ובהצלחה בניסויים שלך.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה דן בשיטה לדימות כמותי של ליפופוסין באפית הפיגמנט של הרשתית (RPE) באמצעות אופטלמוסקופיה בלייזר סורקת קונפוקלית (CSLO). הטכניקה שואפת להעריך את רמות הליפופוסין בעיניים בריאות ובחולות, ובכך לתרום להבנתנו את הביולוגיה של תאי הרשתית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- רפואת עיניים
- ביולוגיה של התא
רקע
- ה-RPE תומך ברשתית החישית על ידי מיחזור תוצרי לוואי של המחזור הראייתי.
- הצטברות של ליפופוסין עשויה להעיד על הבריאות התאית.
- הבנת רמות הליפופוסין היא קריטית לחקר של ניוון רשתית הנגרם מגיל (AMD).
- דימות כמותי מאפשר הערכות הניתנות לשחזור בין מטופלים ומחקרי השוואה.
מטרת המחקר
- להערכה כמותית של רמות הליפופוסין ב-RPE.
- לבחינת הקשר בין בריאות ה-RPE לבין התפתחות AMD.
- לביסוס טכניקת דימות אמינה ליישומים קליניים ומחקריים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הגדרה וכיול של מערכת אופתלמוסקופיה לייזר סורקת קונפוקלית (CSLO).
- שימוש ברפרנס פלואורסצנטי פנימי למדידות מדויקות.
- הרחבת אישונים ללפחות 6mm למעבר אור אופטימלי.
- דימות אוטופלואורסצנציה כמותי של קרקית העין.
תוצאות עיקריות
- דימוג מוצלח של רמות ליפופוסין במצבים שונים של העין.
- קביעת רמות בסיס של אוטופלורסנציה לצורך השוואה.
- הדגמת השחזוריות של הטכניקה לאורך מפגשי דימוג.
- תובנות לגבי תפקידו של הליפופוסין בבריאות ובמחלות של הרשתית.
מסקנות
- דימוי כמותי של ליפופוסין הוא כלי בעל ערך במחקרים על הרשתית.
- שיטה זו משפרת את הבנתנו לגבי התפקוד והפתולוגיה של ה-RPE.
- מחקרים נוספים יכולים להשתמש בטכניקה זו כדי לחקור AMD ומחלות רשתית אחרות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות לתעשייה
פלואורסצנציה עצמית כמותית של קרנית העין (qAF) מאפשרת מדידה מוחלטת וניתנת לשחזור של רמות ליפופוסצין באפיתל הרשתית (RPE), ובכך מספקת סמן ביולוגי למצוקה תאית ודגנרציה במודלים פרה-קליניים של מחלות רשתית. גישה זו תומכת בתיקוף של מטרות טיפוליות על ידי מתאם בין המצב התפקודי של ה-RPE לבין שלמות הרשתית החושית, ובכך מסייעת בהפחתת סיכונים מנגנוניים בתוכניות לגילוי תרופות באופתלמולוגיה. הטכניקה מגבירה את הביטחון החזוי בזיהוי מולקולות מובילות (lead identification) על ידי כך שהיא מאפשרת מעקב אורך של התקדמות פתולוגית במערכות הרלוונטיות למחלה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות באמצעות כימות הצטברות ליפופוסין כמדד לתפקוד הפגוציטוזי והליסוזומלי של ה-RPE במודלים של מחלות.
- ערך תפעולי: מאפשר הפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות הערכה סטנדרטית וניתנת לשחזור של בריאות ה-RPE לאורך תנאים ניסיוניים ונקודות זמן שונות.
- ערך חיזוי: תומך במיון תיקי פיתוח על ידי קישור רמות הליפופוסין ב-RPE למצב של דחק וניוון של הפוטורספטורים, ובכך מספק מידע לביסוס הביטחון במטרה במהלך תיקוף פרה-קליני.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: מכין מודלים מאושרים של רשתית לסריקת תרכובות בהמשך, על ידי קביעת רמות בסיס של ליפופוסין וספי רגישות לגילוי.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה של הבדיקה והדירות באמצעות כיול רפרנס פלואורסצנטי פנימי ופרמטרי דמיוּן מבוקרים.
- ערך סקלאביליות: מאפשר יישום בתפוקה גבוהה באמצעות ממוצע פריימים מהיר ורכישת שטח ראייה סטנדרטי עבור אוכלוסיות מחקר גדולות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: שומר על רצף תרגומי על ידי קישור דפוסי ליפופוסין ב-RPE לשינויים מבניים ברשתית החיצונית, ובכך תומך במידול מחלה התואם לסמנים ביולוגיים.
- ערך תפעולי: מאפשר קבלת החלטות על קידום מבוסס ניהול סיכונים באמצעות מעקב כמותי ואורכי של התקדמות הניוון במחקרים פרה-קליניים.
- ערך ניבוי: משפר את הפחתת הסיכונים המכניסטית על ידי אספקת נתונים אובייקטיביים ומתואמים על ירידה תפקודית ב-RPE שקדמה לאובדן פוטורצפטורים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
אוטופלורסצנציה כמותית משתלבת ברצף הגילוייםB בתחום הפתלוגיה של העין, החל מאישוש מטרות מוקדם ועד להערכת יעילות פרה-קלינית, ובכך מאפשרת קבלת החלטות מבוססות נתונים (go/no-go) בהסתמכות על מדדי בריאות של ה-RPE.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים ביולוגיים על ידי כימות הליפופוסצין כמדד תפקודי לפעילות המטבולית וליזוזומלית של ה-RPE.
- סריקה: מספקת מוכנות לבדיקה באמצעות דימות הניתן לשחזור עם רעש מופחת, באמצעות רכישת ממוצע של 9 פריימים ודימות של שדה ראייה סטנדרטי של 30x30 מעלות.
- אנליזה: מייצרת מפות כמותיות של עוצמת הליפופוסצין וערכי ממוצע אזוריים (למשל, טבעת ריכוזית שנייה) לצורך ניתוח השוואתי בין תנאים שונים ומחקרי אורך.
- מחקר תרגומי: מקשרת מדדי ליפופוסצין של RPE לשלמות הרשתית החושית, מה שמאפשר רצף פרה-קליני כאשר סממנים ביולוגיים מבניים ותפקודיים תואמים.
- שימוש חוזר ארגוני: משמשת כיכולת פלטפורמה הניתנת לשימוש חוזר במודלים של מחלות שונות (למשל, AMD, רטינופתיות תורשתיות) הודות לפרוטוקולי כיול ודימות סטנדרטיים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מספק ביטחון חיזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת העמימות המכניסטית בתקשורת בין ה-RPE לפוטורצפטורים.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה והדירות באמצעות שימוש ברפרנס פנימי, בקרת הרחבת אישונים ופרמטרים עקביים לרכישת תמונות.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי מתן אפשרות לקבלת החלטות go/no-go מוקדמות המבוססות על ביומרקרים כמותיים של עקה ב-RPE.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים באמצעות מעקב אורך, הדיר, אחר התקדמות הניוון במודלים פרה-קליניים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בדימות אופתלמולוגי ובתפעול של אופתלמוסקופ לייזר סורק קונפוקלי (CSLO).
- תלוי במכשור CSLO בעל מצב אוטופלורסצנציה ותאימות למסמך פלואורסצנציה פנימי.
- מחייב סטנדרטיזציה בין הצוותים עבור פרוטוקולים להרחבת אישונים (0.5% tropicamide, 2.5% phenylephrine) ועקביות במפגשי הדימות.
- כולל שיקולי התאמה בין מיני מודלים בשל הבדלים באנטומיה של קרקית העין, פלואורסצנציה של ליפופוסצין וגודל האישון.
- מוגבל בשל סיכון לרוויה של האות כתוצאה מחשיפה ממושכת לאור כחול ועכירות של המדיה, דבר הדורש תזמון חשיפה קפדני ופרוטוקולי מצמוץ.
